انتشار الفيروس والقياس اللوني القائم على الخلايا
Summary
يصف هذا البروتوكول انتشار فيروس زيكا (ZIKV) في خلايا الكلى القردة الخضراء فيرو الأفريقية والقياس الكمي لفيروس زيكا باستخدام طرق الكشف المناعي اللوني القائمة على الخلايا في شكل 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية).
Abstract
فيروس زيكا (ZIKV) هو فيروس ينقله البعوض ينتمي إلى جنس Flavivirus. ارتبطت عدوى فيروس زيكا بتشوهات خلقية في الدماغ وربما متلازمة غيلان باريه لدى البالغين. ومن المهم إجراء البحوث المتعلقة بفيروس زيكا لفهم آليات المرض لتيسير تطوير اللقاح والعلاج. طريقة قياس كمية الفيروسات حاسمة وأساسية في مجال علم الفيروسات. مقايسة تشكيل التركيز (FFA) هي مقايسة كمية للفيروس تكتشف المستضد الفيروسي بالأجسام المضادة وتحدد بؤر العدوى للخلايا باستخدام تقنية التلوين المناعي للبيروكسيداز. تصف الدراسة الحالية بروتوكول انتشار الفيروس والقياس الكمي باستخدام كل من تنسيقات 24 بئرا و 96 بئرا (إنتاجية عالية). بالمقارنة مع دراسات أخرى مماثلة ، وصف هذا البروتوكول كذلك تحسين حجم البؤر ، والذي يمكن أن يكون بمثابة دليل لتوسيع استخدام هذا الفحص للفيروسات الأخرى. أولا ، يتم إجراء انتشار ZIKV في خلايا Vero لمدة 3 أيام. يتم حصاد طافية الاستزراع التي تحتوي على ZIKV وقياسها باستخدام FFA. باختصار ، يتم تلقيح ثقافة الفيروس على خلايا Vero وتحضينها لمدة 2-3 أيام. ثم يتم تحديد تكوين البؤر بعد عمليات تلطيخ محسنة ، بما في ذلك تثبيت الخلايا ، والنفاذية ، والحجب ، وربط الأجسام المضادة ، والحضانة مع ركيزة البيروكسيديز. يتم تصور بؤر الفيروس الملطخة باستخدام مجهر ستيريو (العد اليدوي بتنسيق 24 بئرا) أو محلل البرامج (العد الآلي بتنسيق 96 بئرا). يوفر FFA نتائج قابلة للتكرار وسريعة نسبيا (3-4 أيام) وهو مناسب للاستخدام مع فيروسات مختلفة ، بما في ذلك الفيروسات غير المكونة للبلاك. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول مفيد لدراسة عدوى ZIKV ويمكن استخدامه للكشف عن الفيروسات الأخرى المهمة سريريا.
Introduction
عدوى فيروس زيكا (ZIKV) هي مرض فيروسي ناشئ ينقله البعوض. كانت أول عزلة ل ZIKV في أوغندا في عام 1947 1,2 ؛ ظل مهملا من عام 1947 إلى عام 2007 ، حيث أن الأعراض السريرية هي الأكثر شيوعا بدون أعراض وتتميز بمرض حموي ذاتي الحد. في عام 2007 ، بدأ وباء زيكا في جزر ياب 3,4 ، تلاه أوبئة أكبر في مناطق المحيط الهادئ (بولينيزيا الفرنسية وجزيرة إيستر وجزر كوك وكاليدونيا الجديدة) من 2013 إلى 2014 5،6،7،8 ، حيث تم الإبلاغ عن المضاعفات العصبية الشديدة متلازمة غيلان باريه (GBS) في البالغين لأول مرة9. خلال عامي 2015 و 2016 ، اجتاح أول وباء ZIKV واسع الانتشار الأمريكتين بعد ظهور النمط الجيني الآسيوي ل ZIKV في البرازيل في وقت مبكر من عام 201310. خلال هذه الفاشية ، تم الإبلاغ عن 440,000 إلى 1.3 مليون حالة من صغر الرأس ، واضطرابات عصبية أخرى ، في الأطفال حديثي الولادة11. لا يوجد حاليا علاج أو علاج محدد لعدوى فيروس زيكا. وبالتالي، هناك حاجة طبية ملحة للقاحات فيروس زيكا القادرة على الوقاية من العدوى، لا سيما أثناء الحمل.
القياس الكمي للفيروس هو عملية لتحديد عدد الفيروسات الموجودة في العينة. يلعب دورا مهما في البحث ، وتشمل المختبرات الأكاديمية العديد من المجالات ، مثل الطب وعلوم الحياة. هذه العملية مهمة أيضا في القطاعات التجارية ، مثل إنتاج اللقاحات الفيروسية أو البروتينات المؤتلفة أو المستضدات الفيروسية أو العوامل المضادة للفيروسات. يمكن استخدام العديد من الطرق أو المقايسات لقياس كمية الفيروس12. يعتمد اختيار الطرق أو المقايسات عادة على خصائص الفيروس ومستوى الدقة المطلوب وطبيعة التجربة أو البحث. بشكل عام ، يمكن تقسيم طرق قياس الفيروسات إلى فئتين: المقايسات الجزيئية التي تكشف عن وجود الحمض النووي الفيروسي (DNA أو RNA) والمقايسات التي تقيس عدوى الفيروس في المختبر12. يعد تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR ، للحمض النووي) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR ، للحمض النووي الريبي)13 والقطيرات الرقمية PCR14 أمثلة على التقنيات الجزيئية الشائعة المستخدمة لتحديد كمية الحمض النووي الفيروسي في عينة معينة15. ومع ذلك ، لا يمكن لهذه التقنيات الجزيئية شديدة الحساسية التمييز بين الفيروسات القابلة للحياة وغير القابلة للحياة15. لذلك ، لا يمكن إكمال البحث الذي يتطلب معلومات عن السمات البيولوجية ، مثل عدوى الفيروس على الخلايا ، باستخدام التقنيات الجزيئية المذكورة أعلاه ؛ هناك حاجة إلى فحوصات يمكنها قياس وتحديد وجود فيروسات قابلة للحياة. تشمل المقايسات التي تقيس عدوى الفيروس مقايسة تكوين البلاك (PFA) ، والجرعة المعدية لزراعة الأنسجة بنسبة 50٪ (TCID50) ، ومقايسة تركيز الفلورسنت ، والمجهر الإلكتروني الانتقالي (TEM) 12.
يعد PFA ، الذي طوره Renato Dulbecco في عام 1952 ، أحد أكثر الطرق شيوعا لمعايرة الفيروس ، بما في ذلك ZIKV16. يتم استخدامه لتحديد التركيزات الفيروسية مباشرة للفيروسات المعزولة المعدية. تعتمد الطريقة على قدرة الفيروس المحلل على إنتاج تأثيرات اعتلال خلوي (CPEs ؛ مناطق موت الخلايا أو اللويحات ، وهي منطقة عدوى محاطة بخلايا غير مصابة) في طبقة أحادية الخلية الملقحة بعد العدوى الفيروسية. ومع ذلك ، هناك العديد من العيوب للفحص التي تؤثر على فائدتها. تستغرق عملية الفحص وقتا طويلا (تستغرق حوالي 7-10 أيام ، اعتمادا على الفيروسات) ، وتعتمد على CPE ، وعرضة للأخطاء. في هذه الدراسة ، أبلغنا عن تقنية قياس الألوان المناعية ، مقايسة تشكيل التركيز (FFA) ، للكشف عن ZIKV وقياسه في تنسيقات صفيحة 24 بئرا و 96 بئرا.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك العديد من المقايسات لتحديد عيار الفيروس. لدى PFA بروتوكول كمي مشابه للفيروس مثل FFA ، حيث يتم تخفيف لقاح الفيروس للسماح بتمييز اللويحات أو البؤر الفردية. بعد تلطيخ ، تشير كل لوحة أو بؤر إلى جسيم معدي واحد في اللقاح19. PFA ملطخ باللون البنفسجي البلوري لتصور تكوين البلاك الناجم ع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى هذا البحث دعما من وزارة التعليم العالي الماليزية في إطار برنامج المنح البحثية طويلة الأجل (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN / F1 / 01/2018) وتمويل برنامج مركز التميز للمؤسسات العليا (HICoE) (MO002-2019). الشكل 3 في هذه الدراسة الذي يوضح سير عمل التلوين لمقايسة تشكيل البؤر مقتبس من “DAB Immunohistochemistry” بواسطة BioRender.com (2022). تم الاسترجاع من https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
