Propagazione del virus e quantificazione colorimetrica cellulare
Summary
Il presente protocollo descrive la propagazione del virus Zika (ZIKV) in cellule renali di scimmia verde africana Vero e la quantificazione di ZIKV utilizzando metodi di immunorilevazione colorimetrica basati su cellule nei formati a 24 e 96 pozzetti (high throughput).
Abstract
Il virus Zika (ZIKV) è un virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus. L’infezione da ZIKV è stata associata ad anomalie cerebrali congenite e potenzialmente alla sindrome di Guillain-Barré negli adulti. La ricerca su ZIKV per comprendere i meccanismi della malattia è importante per facilitare lo sviluppo di vaccini e trattamenti. Il metodo di quantificazione dei virus è cruciale e fondamentale nel campo della virologia. Il focus forming assay (FFA) è un test di quantificazione del virus che rileva l’antigene virale con gli anticorpi e identifica i focolai di infezione delle cellule utilizzando la tecnica di immunocolorazione della perossidasi. L’attuale studio descrive il protocollo di propagazione e quantificazione del virus utilizzando sia i formati a 24 pozzetti che a 96 pozzetti (high throughput). Rispetto ad altri studi simili, questo protocollo ha ulteriormente descritto l’ottimizzazione delle dimensioni dei focolai, che può servire come guida per espandere l’uso di questo test per altri virus. In primo luogo, la propagazione di ZIKV viene eseguita in cellule Vero per 3 giorni. Il surnatante di coltura contenente ZIKV viene raccolto e quantificato utilizzando l’FFA. In breve, la coltura virale viene inoculata su cellule Vero e incubata per 2-3 giorni. La formazione di focolai viene quindi determinata dopo processi di colorazione ottimizzati, tra cui la fissazione cellulare, la permeabilizzazione, il blocco, il legame degli anticorpi e l’incubazione con substrato di perossidasi. I focolai virali colorati vengono visualizzati utilizzando uno stereomicroscopio (conteggio manuale in formato a 24 pozzetti) o un analizzatore software (conteggio automatizzato in formato a 96 pozzetti). L’FFA fornisce risultati riproducibili e relativamente rapidi (3-4 giorni) ed è adatto per essere utilizzato per diversi virus, compresi quelli che non formano placca. Successivamente, questo protocollo è utile per lo studio dell’infezione da ZIKV e potrebbe essere utilizzato per rilevare altri virus clinicamente importanti.
Introduction
L’infezione da virus Zika (ZIKV) è una malattia virale emergente trasmessa dalle zanzare. Il primo isolamento di ZIKV avvenne in Uganda nel 1947 1,2; È rimasta trascurata dal 1947 al 2007, poiché i sintomi clinici sono più comunemente asintomatici e caratterizzati da malattia febbrile autolimitante. Nel 2007, l’epidemia di Zika è iniziata nelle isole Yap 3,4, seguita da epidemie più grandi nelle regioni del Pacifico (Polinesia francese, Isola di Pasqua, Isole Cook e Nuova Caledonia) dal 2013 al 2014 5,6,7,8, dove la grave complicanza neurologica sindrome di Guillain-Barré (GBS) è stata segnalata per la prima volta negli adulti 9. Tra il 2015 e il 2016, la prima epidemia diffusa di ZIKV si è diffusa nelle Americhe dopo l’emergere del genotipo asiatico di ZIKV in Brasile già nel 201310. Durante questa epidemia, sono stati segnalati da 440.000 a 1,3 milioni di casi di microcefalia e altri disturbi neurologici nei neonati. Attualmente non esiste una cura o un trattamento specifico per l’infezione da ZIKV; quindi, c’è un urgente bisogno medico di vaccini ZIKV in grado di prevenire le infezioni, in particolare durante la gravidanza.
La quantificazione dei virus è un processo per determinare il numero di virus presenti in un campione. Svolge un ruolo importante nella ricerca e i laboratori accademici coinvolgono molti campi, come la medicina e le scienze della vita. Questo processo è importante anche in settori commerciali, come la produzione di vaccini virali, proteine ricombinanti, antigeni virali o agenti antivirali. Per la quantificazione dei virus possono essere utilizzati molti metodi o saggi12. La scelta dei metodi o dei saggi dipende normalmente dalle caratteristiche del virus, dal livello di accuratezza desiderato e dalla natura dell’esperimento o della ricerca. In generale, i metodi di quantificazione dei virus possono essere suddivisi in due categorie: saggi molecolari che rilevano la presenza di acido nucleico virale (DNA o RNA) e saggi che misurano l’infettività del virus in vitro12. La reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR, per il DNA) o la reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR, per l’RNA)13 e la PCR a goccia digitale14 sono esempi di tecniche molecolari comuni utilizzate per quantificare l’acido nucleico virale in un dato campione15. Tuttavia, queste tecniche molecolari altamente sensibili non sono in grado di distinguere tra virus vitali e non vitali15. Pertanto, le ricerche che richiedono informazioni sulle caratteristiche biologiche, come l’infettività del virus sulle cellule, non possono essere completate utilizzando le tecniche molecolari sopra menzionate; Sono necessari saggi in grado di misurare e determinare la presenza di virus vitali. I saggi che misurano l’infettività del virus includono il test di formazione della placca (PFA), la dose infettiva di coltura tissutale al 50% (TCID50), il test di focalizzazione fluorescente e la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)12.
Il PFA, sviluppato da Renato Dulbecco nel 1952, è uno dei metodi più comunemente utilizzati per la titolazione del virus, anche per ZIKV16. Viene utilizzato per determinare direttamente le concentrazioni virali per i virioni litici infettivi. Il metodo si basa sulla capacità di un virus litico di produrre effetti citopatici (CPE; zone di morte cellulare o placche, un’area di infezione circondata da cellule non infette) in un monostrato di cellule inoculate dopo l’infezione virale. Tuttavia, ci sono diversi inconvenienti nel test che ne influenzano l’utilità. Il test richiede molto tempo (richiede circa 7-10 giorni, a seconda dei virus), dipende da CPE ed è soggetto a errori. Nel presente studio, riportiamo una tecnica immunocolorimetrica, il test di formazione del fuoco (FFA), per rilevare e quantificare ZIKV in formati di piastra a 24 pozzetti e piastra a 96 pozzetti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esistono diversi test per determinare il titolo del virus; il PFA ha un protocollo di quantificazione del virus simile a quello dell’FFA, in cui l’inoculo virale viene diluito per consentire di distinguere le singole placche o focolai. Dopo la colorazione, ogni placca o focolai indica una singola particella infettiva nell’inoculo19. Il PFA è colorato con cristallo viola per visualizzare la formazione di placca causata dalla lisi o dalla morte cellulare. Quindi, il PFA richiede più tempo, in quan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Ministero dell’Istruzione Superiore della Malesia nell’ambito del Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) e il finanziamento del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019). La figura 3 di questo studio, che mostra il flusso di lavoro della colorazione per il test di formazione dei focolai, è adattata da “DAB Immunoistochemistry” di BioRender.com (2022). Estratto da https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
