Propagação de vírus e quantificação colorimétrica baseada em células
Summary
O presente protocolo descreve a propagação do vírus Zika (ZIKV) em células Vero African green monkey kidney e a quantificação do ZIKV usando métodos de imunodetecção colorimétrica baseados em células nos formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento).
Abstract
O vírus Zika (ZIKV) é um vírus transmitido por mosquitos pertencente ao gênero Flavivirus. A infecção pelo VZIK tem sido associada a anormalidades cerebrais congênitas e potencialmente à síndrome de Guillain-Barré em adultos. Pesquisas sobre o VZIK para entender os mecanismos da doença são importantes para facilitar o desenvolvimento de vacinas e tratamentos. O método de quantificação de vírus é crucial e fundamental no campo da virologia. O focus forming assay (FFA) é um ensaio de quantificação viral que detecta o antígeno viral com anticorpos e identifica os focos de infecção das células usando a técnica de imunomarcação da peroxidase. O presente estudo descreve o protocolo de propagação e quantificação do vírus usando os formatos de 24 e 96 poços (alto rendimento). Em comparação com outros estudos semelhantes, este protocolo descreveu melhor a otimização do tamanho dos focos, o que pode servir como um guia para expandir o uso deste ensaio para outros vírus. Primeiramente, a propagação do VZIK é realizada em células Vero por 3 dias. O sobrenadante da cultura contendo ZIKV é colhido e quantificado usando o FFA. Resumidamente, a cultura do vírus é inoculada em células Vero e incubada por 2-3 dias. A formação de focos é então determinada após processos de coloração otimizados, incluindo fixação celular, permeabilização, bloqueio, ligação de anticorpos e incubação com substrato peroxidase. Os focos virais corados são visualizados por estereomicroscópio (contagem manual em formato de 24 poços) ou analisador de software (contagem automatizada em formato de 96 poços). O FFA fornece resultados reprodutíveis, relativamente rápidos (3-4 dias) e é adequado para ser usado para diferentes vírus, incluindo vírus não formadores de placa. Posteriormente, este protocolo é útil para o estudo da infecção pelo VZIK e pode ser usado para detectar outros vírus clinicamente importantes.
Introduction
A infecção pelo vírus Zika (ZIKV) é uma doença viral emergente transmitida por mosquitos. O primeiro isolamento do VZIK foi em Uganda, em 1947 1,2; permaneceu negligenciada de 1947 a 2007, pois os sintomas clínicos são mais comumente assintomáticos e caracterizados por doença febril autolimitada. Em 2007, a epidemia de Zika teve início nas ilhas Yap 3,4, seguida por epidemias maiores nas regiões do Pacífico (Polinésia Francesa, Ilha de Páscoa, Ilhas Cook e Nova Caledônia) de 2013 a 2014 5,6,7,8, onde a complicação neurológica grave síndrome de Guillain-Barré (SGB) foi relatada em adultos pela primeira vez9. Durante os anos de 2015 e 2016, a primeira epidemia generalizada de VZIK varreu as Américas após o surgimento do genótipo asiático do VZIK no Brasil já em 201310. Durante esse surto, 440.000 a 1,3 milhão de casos de microcefalia e outros distúrbios neurológicos foram relatados em recém-nascidos11. Atualmente, não há cura ou tratamento específico para a infecção pelo VZIK; portanto, há uma necessidade médica urgente de vacinas contra o VZIK capazes de prevenir infecções, particularmente durante a gravidez.
A quantificação de vírus é um processo para determinar o número de vírus presentes em uma amostra. Desempenha um papel importante na pesquisa, e os laboratórios acadêmicos envolvem muitos campos, como medicina e ciências da vida. Esse processo também é importante em setores comerciais, como a produção de vacinas virais, proteínas recombinantes, antígenos virais ou agentes antivirais. Muitos métodos ou ensaios podem ser utilizados para a quantificação do vírus12. A escolha de métodos ou ensaios normalmente depende das características do vírus, do nível de precisão desejado e da natureza do experimento ou pesquisa. Em geral, os métodos de quantificação de vírus podem ser divididos em duas categorias: ensaios moleculares que detectam a presença de ácido nucleico viral (DNA ou RNA) e ensaios que medem a infectividade viral in vitro12. A reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR, para DNA) ou a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR, para RNA)13 e a PCR digital em gotículas14 são exemplos de técnicas moleculares comuns usadas para quantificar o ácido nucleico viral em uma determinadaamostra15. No entanto, essas técnicas moleculares altamente sensíveis não conseguem diferenciar vírus viáveis de não viáveis15. Portanto, pesquisas que requerem informações sobre características biológicas, como a infectividade do vírus nas células, não podem ser concluídas usando as técnicas moleculares acima mencionadas; ensaios que possam medir e determinar a presença de vírus viáveis são necessários. Os ensaios que medem a infectividade do vírus incluem o ensaio de formação de placa (PFA), a dose infecciosa de cultura de tecido a 50% (TCID50), o ensaio de foco fluorescente e a microscopia eletrônica de transmissão (MET)12.
O PFA, desenvolvido por Renato Dulbecco em 1952, é um dos métodos mais utilizados para titulação de vírus, inclusive para o ZIKV16. É usado para determinar diretamente as concentrações virais para virions líticos infecciosos. O método é baseado na capacidade de um vírus lítico produzir efeitos citopáticos (CPEs; zonas de morte celular ou placas, uma área de infecção cercada por células não infectadas) em uma monocamada celular inoculada após a infecção viral. No entanto, existem várias desvantagens no ensaio que afetam sua utilidade. O ensaio é demorado (leva aproximadamente 7-10 dias, dependendo dos vírus), dependente do CPE e propenso a erros. No presente estudo, relatamos uma técnica imunocolorimétrica, o focus forming assay (FFA), para detecção e quantificação do VZIK nos formatos de placa de 24 e 96 poços.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem vários ensaios para determinar o título do vírus; o PFA tem um protocolo de quantificação viral semelhante ao FFA, no qual o inóculo do vírus é diluído para permitir a distinção de placas ou focos individuais. Após a coloração, cada placa ou foco indica uma única partícula infecciosa no inóculo19. O PFA é corado com cristal violeta para visualizar a formação de placa causada por lise ou morte celular. Assim, o PFA é mais demorado, pois requer um tempo maior para que o …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa recebeu apoio do Ministério do Ensino Superior da Malásia sob o Esquema de Bolsas de Pesquisa de Longo Prazo (LRGS MRUN Fase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018) e financiamento para o programa do Centro de Excelência da Instituição Superior (HICoE) (MO002-2019). A Figura 3 deste estudo que mostra o fluxo de coloração para o ensaio de formação de focos é adaptada de “DAB Immunohistochemistry” por BioRender.com (2022). Retirado de https://app.biorender.com/biorender-templates/t-5f3edb2eb20ace00af8faed9-dab-immunohistochemistry.
Materials
| 0.22 µm Polyethersulfone syringe filter | Sartorius | S6534-FMOSK | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Nest | 615601 | |
| 10 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955156 | |
| 1x Dulbecco’s phosphate-buffered saline (dPBS) | Gibco | 14190-136 | |
| 2.0 mL Screw cap tube | Axygen | SCT-200-SS-C-S | |
| 24-well plate | Corning | 3526 | |
| 25 mL Sterile serological pipettes | Labserv | 14955157 | |
| 3,3'Diaminobenzidine (DAB) peroxidase substrate | Thermo Scientific | 34065 | |
| 37 °C incubator with 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 5 mL sterile serological pipette | Labserv | 14955155 | |
| 50 mL centrifuge tube | Falcon | LAB352070 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning | 430725U | |
| 96-well plate | Falcon | 353072 | |
| Anti-flavivirus monoclonal antibody, 4G2 (clone D1-4G2-4-15) | MilliporeSigma | MAB10216 | |
| Autoclaved 20x Phosphate buffered saline (PBS) | N/A | N/A | 22.8 g of 8 mM Na2HPO4, 4.0 g of 1.5 mM KH2PO4, 160 g of 0.14 M NaCl, 4.0 g of 2.7 mM KCl, 1 L of MilliQ H2O |
| Biological safety cabinet, Class II | Holten | HB2448 | |
| CTL S6 Universal ELISpot/FluoroSpot Analyzer | ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL) | CTL-S6UNV12 | Commercial software analyzer |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 12800-017 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen | SFBS | |
| Goat anti-mouse IgG secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (HRP) | MilliporeSigma | 12-349 | |
| Hemacytometer | Laboroptik LTD | Neubauer improved | |
| IGEPAL CA-630 detergent | Sigma-Aldrich | I8896 | Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL |
| Inverted microscope | ZEISS | TELAVAL 31 | |
| Laboratory rocker | FINEPCR | CR300 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| Low viscosity carboxymethyl cellulose (CMC) | Sigma-Aldrich | C5678 | |
| Multichannel micropipette (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Multichannel micropipette (30 – 300 µL) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Single channel pipettes (10 – 100 µL) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Single channel pipettes (100 – 1000 µL) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Single channel pipettes (20 – 200 µL) | Eppendorf | 3123000055 | |
| Skim milk | Sunlac Low Fat | N/A | Prepare 3% Skim milk in 1x PBS for blocking stage in staining |
| Sodium Hypochlorite | Clorox | N/A | To disinfect any discarded infectious liquid waste from flasks/plates |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1000 | |
| Syringe disposable, Luer Lock, 10 mL with 21 G Needle | Terumo | SS10L21G | |
| Vero African green monkey kidney cells | – | ECACC 88020401 | Received from collaborator. However, Vero cells obtained from other suppliers should be able to be used with some optimization. |
References
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), 509-520 (1952).
- Dick, G. W. A., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 46 (5), (1952).
- Duffy, M. R., et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2536-2543 (2009).
- Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clinical Microbiology and Infection. 20 (10), O595-O596 (2014).
- Cao-Lormeau, V. -. M., et al. Zika virus, French polynesia, South pacific, 2013. Emerging Infectious Diseases. 20 (6), 1085-1086 (2014).
- Dupont-Rouzeyrol, M., et al. Co-infection with Zika and dengue viruses in 2 patients, New Caledonia, 2014. Emerging Infectious Diseases. 21 (2), 381-382 (2015).
- Roth, A., et al. Concurrent outbreaks of dengue, chikungunya and Zika virus infections-an unprecedented epidemic wave of mosquito-borne viruses in the Pacific 2012-2014. Euro Surveillance. 19 (41), 20929 (2014).
- Tognarelli, J., et al. A report on the outbreak of Zika virus on Easter Island, South Pacific, 2014. Archives of Virology. 161 (3), 665-668 (2016).
- Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome-case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveillance. 19 (9), 20720 (2014).
- Faria, N. R., et al. Zika virus in the Americas: early epidemiological and genetic findings. Science. 352 (6283), 345-349 (2016).
- Rapid risk assessment: Zika virus epidemic in the Americas: potential association with microcephaly and Guillain-Barré syndrome – 4th update. European Centre for Disease Prevention and Control Available from: https://www.ecdc.europa.eu/en/publications-data/rapid-risk-assessment-zika-virus-epidemic-americas-potential-association (2015)
- Payne, S. Methods to study viruses. Viruses. , 37-52 (2017).
- Bustin, S. A., Mueller, R. Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clinical Science. 109 (4), 365-379 (2005).
- Sedlak, R. H., Jerome, K. R. Viral diagnostics in the era of digital polymerase chain reaction. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 75 (1), 1-4 (2013).
- Bae, H. -. G., Nitsche, A., Teichmann, A., Biel, S. S., Niedrig, M. Detection of yellow fever virus: a comparison of quantitative real-time PCR and plaque assay. Journal of Virological Methods. 110 (2), 185-191 (2003).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 38 (8), 747-752 (1952).
- Nahapetian, A. T., Thomas, J. N., Thilly, W. G. Optimization of environment for high density Vero cell culture: effect of dissolved oxygen and nutrient supply on cell growth and changes in metabolites. Journal of Cell Science. 81, 65-103 (1986).
- Agbulos, D. S., Barelli, L., Giordano, B. V., Hunter, F. F. Zika virus: quantification, propagation, detection, and storage. Current Protocols in Microbiology. 43, (2016).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, (2013).
- Bolívar-Marin, S., Bosch, I., Narváez, C. F. Combination of the focus-forming assay and digital automated imaging analysis for the detection of dengue and Zika viral loads in cultures and acute disease. Journal of Tropical Medicine. 2022, 2177183 (2022).
- Dangsagul, W., et al. Zika virus isolation, propagation, and quantification using multiple methods. PLoS One. 16 (7), e0255314 (2021).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Lazear, H. M., et al. A mouse model of Zika virus pathogenesis. Cell Host & Microbe. 19 (5), 720-730 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika virus infection during pregnancy in mice causes placental damage and fetal demise. Cell. 165 (5), 1081-1091 (2016).
- Kang, W., Shin, E. -. C. Colorimetric focus-forming assay with automated focus counting by image analysis for quantification of infectious hepatitis C virions. PLoS One. 7 (8), e43960 (2012).
- Brien, J. D., et al. Isolation and quantification of Zika virus from multiple organs in a mouse. Journal of VIsualized Experiments. (150), e59632 (2019).
- Payne, A. F., Binduga-Gajewska, I., Kauffman, E. B., Kramer, L. D. Quantitation of flaviviruses by fluorescent focus assay. Journal of Virological Methods. 134 (1-2), 183-189 (2006).
- Moser, L. A., et al. Growth and adaptation of Zika virus in mammalian and mosquito cells. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (11), e0006880 (2018).
- Ishimine, T., Tadano, M., Fukunaga, T., Okuno, Y. An improved micromethod for infectivity assays and neutralization tests of dengue viruses. Biken Journal. 30 (2), 39-44 (1987).
- Leiva, S., et al. Application of quantitative immunofluorescence assays to analyze the expression of cell contact proteins during Zika virus infections. Virus Research. 304, 198544 (2021).
- Lee, E. M., Titus, S. A., Xu, M., Tang, H., Zheng, W. High-throughput Zika viral titer assay for rapid screening of antiviral drugs. ASSAY and Drug Development Technologies. 17 (3), 128-139 (2019).
