In vivo Estudio en tiempo real de los efectos de los fármacos sobre el flujo sanguíneo carotídeo en el feto ovino
Summary
El presente protocolo describe un método para administrar fármacos y agentes modificadores de la expresión génica por vía perivascular en un feto en desarrollo intrauterino . Es importante destacar que el efecto de los fármacos/agentes sobre el flujo sanguíneo puede medirse con la progresión del embarazo.
Abstract
La capacidad de un organismo para mantener un flujo sanguíneo constante al cerebro en respuesta a aumentos repentinos de la presión arterial sistémica (PA) se conoce como autorregulación cerebral (CAR), que se produce en la arteria carótida. A diferencia de los recién nacidos a término, los recién nacidos prematuros son incapaces de reducir el flujo sanguíneo cerebral (CBF) en respuesta al aumento de la presión arterial sistémica. En los recién nacidos prematuros, esto expone los frágiles vasos cerebrales a altas presiones de perfusión, lo que lleva a su ruptura y daño cerebral. Los estudios ex vivo que utilizan miografía en alambre han demostrado que las arterias carótidas de fetos a corto plazo se contraen en respuesta a la activación de los receptores alfa1 adrenérgicos. Esta respuesta se ve atenuada en el feto prematuro. Por lo tanto, para examinar el papel de alfa1-AR in vivo, se presenta aquí un enfoque innovador para determinar los efectos de los fármacos en un segmento arterial carotídeo in vivo en un feto ovino durante la progresión del desarrollo de la gestación. Los datos presentados demuestran la medición simultánea del flujo sanguíneo fetal y la presión arterial. El sistema de administración perivascular se puede utilizar para realizar un estudio a largo plazo durante varios días. Las aplicaciones adicionales de este método podrían incluir sistemas de administración viral para alterar la expresión de genes en un segmento de la arteria carótida. Estos métodos podrían aplicarse a otros vasos sanguíneos en el organismo en crecimiento en el útero , así como en organismos adultos.
Introduction
El parto causa estrés al feto, y hay un aumento considerable en los niveles de catecolaminas, la principal hormona del estrés 1,2. Esto eleva la PA sistémica, y si esta presión se transmite a los frágiles capilares cerebrales a través de las arterias carótidas, esto puede llevar a su ruptura 3,4,5. Los aumentos repentinos de la presión arterial sistémica evitan que lleguen al cerebro mediante la constricción de las arterias carótidas en el feto a término. Sin embargo, este mecanismo no está desarrollado en el feto prematuro, y esto es responsable de la probabilidad significativamente mayor de daño cerebral en los fetos prematuros 4,5.
En la actualidad, no existe un método adecuado para examinar la maduración de las vías implicadas en la regulación del flujo sanguíneo carotídeo en fetos en desarrollo. Estos estudios sobre el flujo sanguíneo carotídeo y la vasorreactividad son cruciales tanto desde el punto de vista de la ciencia básica como desde el punto de vista clínico. Actualmente, para determinar las vías moleculares implicadas en la regulación de la contractilidad arterial, el método estándar consiste en aislar los segmentos arteriales postmortem. A continuación, los experimentos se llevan a cabo mediante miografía en alambre para determinar la vasocontractilidad de diferentes moléculas farmacológicas que definen las vías reguladoras implicadas en la contractilidad arterial 6,7. Cabe destacar que los hallazgos ex vivo no son capaces de replicar completamente el entorno in vivo debido a la regulación del flujo sanguíneo aguas arriba y aguas abajo de la arteria carótida. Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo desarrollar una técnica que pueda determinar los efectos de sustancias químicas o agentes vasosensibles sobre el flujo sanguíneo en una arteria in vivo.
La metodología de administración perivascular descrita en este artículo proporciona un enfoque in vivo para estudiar el efecto de la manipulación farmacológica o genética de las vías de señalización en diferentes segmentos arteriales. Con este método, se puede manipular la presión arterial fetal y el flujo sanguíneo carotídeo. Además, se demuestran experimentos con fetos de ovejas para estudiar los efectos de las moléculas de señalización en un feto en desarrollo. Es de esperar que la metodología detallada proporcionada conduzca a nuevas investigaciones en el campo de los estudios del flujo sanguíneo, especialmente en relación con la fisiología y la patología fetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
En la actualidad, no existe ningún método para examinar la contractilidad y la dilatación de los vasos in vivo en respuesta a compuestos farmacológicos y manipulación génica. Como estándar en el campo, el flujo sanguíneo in vivo se mide mediante sondas de flujo Doppler, microesferas y moléculas radiactivas como el agua tritiada. Sin embargo, para manipular las funciones de los receptores o la señalización posterior, los animales son sacrificados y los experimentos se llevan a cabo in vitr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Para estos estudios se utilizaron fondos internos de la Universidad de Arizona.
Materials
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
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