In vivo Real-time studie van geneesmiddeleffecten op de bloedstroom van de halsslagader bij de schapenfoetus
Summary
Het huidige protocol beschrijft een methode om geneesmiddelen en genexpressiemodificerende middelen perivasculair toe te dienen in een in utero ontwikkelende foetus. Belangrijk is dat het effect van medicijnen/middelen op de bloedstroom kan worden gemeten met de progressie van de zwangerschap.
Abstract
Het vermogen van een organisme om een constante bloedtoevoer naar de hersenen te handhaven als reactie op plotselinge pieken in de systemische bloeddruk (BP) staat bekend als cerebrale autoregulatie (CAR), die optreedt in de halsslagader. In tegenstelling tot voldragen pasgeborenen zijn te vroeg geboren pasgeborenen niet in staat om de cerebrale bloedstroom (CBF) te verminderen als reactie op een verhoogde systemische bloeddruk. Bij te vroeg geboren pasgeborenen stelt dit de fragiele hersenvaten bloot aan hoge perfusiedruk, wat leidt tot hun breuk en hersenbeschadiging. Ex vivo-studies met behulp van draadmyografie hebben aangetoond dat halsslagaders van foetussen op korte termijn vernauwen als reactie op de activering van adrenerge alfa1-receptoren. Deze reactie is afgestompt bij de te vroeg geboren foetus. Dus, om de rol van alfa1-AR in vivo te onderzoeken, wordt hier een innovatieve benadering gepresenteerd om de effecten van geneesmiddelen op een halsslagadersegment in vivo bij een schapenfoetus te bepalen tijdens de ontwikkelingsprogressie van de zwangerschap. De gepresenteerde gegevens demonstreren de gelijktijdige meting van de foetale bloedstroom en bloeddruk. Het perivasculaire toedieningssysteem kan worden gebruikt om een langetermijnonderzoek over meerdere dagen uit te voeren. Aanvullende toepassingen voor deze methode zijn onder meer virale afgiftesystemen om de expressie van genen in een segment van de halsslagader te veranderen. Deze methoden kunnen zowel in utero als in volwassen organismen worden toegepast op andere bloedvaten in het groeiende organisme.
Introduction
De geboorte veroorzaakt stress bij de foetus en er is een aanzienlijke toename van de niveaus van catecholamine, het belangrijkste stresshormoon 1,2. Dit verhoogt de systemische bloeddruk en als deze druk via de halsslagaders wordt doorgegeven aan de fragiele haarvaten van de hersenen, kan dit leiden tot hun breuk 3,4,5. Pieken in systemische bloeddruk worden verhinderd om de hersenen te bereiken door de vernauwing van de halsslagaders bij de voldragen foetus. Dit mechanisme is echter niet ontwikkeld bij de te vroeg geboren foetus, en dit is verantwoordelijk voor de significant hogere kans op hersenbeschadiging bij te vroeg geboren foetussen 4,5.
Momenteel bestaat er geen geschikte methode om de rijping te onderzoeken van de routes die betrokken zijn bij het reguleren van de bloedstroom van de halsslagader bij zich ontwikkelende foetussen. Deze studies naar de doorbloeding van de halsslagader en de vasoresponsiviteit zijn cruciaal vanuit zowel fundamenteel wetenschappelijk als klinisch perspectief. Om de moleculaire routes te bepalen die betrokken zijn bij de regulatie van arteriële contractiliteit, omvat de standaardmethode momenteel het postmortem isoleren van de arteriële segmenten. Vervolgens worden de experimenten uitgevoerd met behulp van draadmyografie om de vasocontractiliteit te bepalen van verschillende farmacologische moleculen die de regulerende routes definiëren die betrokken zijn bij arteriële contractiliteit 6,7. Merk op dat de ex vivo bevindingen niet in staat zijn om de in vivo omgeving volledig te repliceren vanwege de regulering van de bloedstroom stroomopwaarts en stroomafwaarts van de halsslagader. De huidige studie was dus gericht op het ontwikkelen van een techniek die de effecten van vaatresponsieve chemicaliën of middelen op de bloedstroom in een slagader in vivo kan bepalen.
De perivasculaire toedieningsmethodologie die in dit artikel wordt beschreven, biedt een in vivo benadering om het effect van de farmacologische of genetische manipulatie van signaalroutes op verschillende arteriële segmenten te bestuderen. Met behulp van deze methode kan men de foetale bloeddruk en de bloedstroom van de halsslagader manipuleren. Daarnaast worden experimenten met schapenfoetussen gedemonstreerd voor het bestuderen van de effecten van signaalmoleculen in een zich ontwikkelende foetus. Hopelijk zal de gedetailleerde methodologie leiden tot nieuw onderzoek op het gebied van bloedstroomstudies, vooral met betrekking tot foetale fysiologie en pathologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Momenteel bestaat er geen methode om de contractiliteit en dilatatie van bloedvaten in vivo te onderzoeken als reactie op geneesmiddelverbindingen en genmanipulatie. Als standaard in het veld wordt in vivo de bloedstroom gemeten door Doppler-flowsondes, microsferen en radioactieve moleculen zoals getritieerd water. Om de functies van de receptoren of stroomafwaartse signalering te manipuleren, worden de dieren echter geofferd en worden experimenten in vitro uitgevoerd in orgaanbaden na isolatie…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Voor deze studies werden intramurale fondsen van de Universiteit van Arizona gebruikt.
Materials
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A. The "stress" of being born. Scientific American. 254 (4), 100-107 (1986).
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
