Im lebenden Organismus Echtzeitstudie zu Arzneimittelwirkungen auf den Karotisblutfluss beim Schaffötus
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur perivaskulären Verabreichung von Medikamenten und Genexpressionsmodifizierungsmitteln in einem sich in utero entwickelnden Fötus. Wichtig ist, dass die Wirkung von Medikamenten / Wirkstoffen auf den Blutfluss mit dem Fortschreiten der Schwangerschaft gemessen werden kann.
Abstract
Die Fähigkeit eines Organismus, als Reaktion auf plötzliche Anstiege des systemischen Blutdrucks (BP) einen konstanten Blutfluss zum Gehirn aufrechtzuerhalten, wird als zerebrale Autoregulation (CAR) bezeichnet, die in der Halsschlagader auftritt. Im Gegensatz zu Vollzeit-Neugeborenen sind Frühgeborene nicht in der Lage, den zerebralen Blutfluss (CBF) als Reaktion auf einen erhöhten systemischen Blutdruck zu reduzieren. Bei Frühgeborenen werden die fragilen Hirngefäße dadurch einem hohen Perfusionsdruck ausgesetzt, was zu ihrem Bruch und Hirnschäden führt. Ex-vivo-Studien mit Drahtmyographie haben gezeigt, dass sich die Halsschlagadern von kurzfristigen Föten als Reaktion auf die Aktivierung adrenerger alpha1-Rezeptoren verengen. Diese Reaktion ist beim Frühgeborenen abgestumpft. Um die Rolle von alpha1-AR in vivo zu untersuchen, wird hier ein innovativer Ansatz vorgestellt, um die Auswirkungen von Medikamenten auf ein Halsschlagadersegment in vivo bei einem Schaffötus während des Entwicklungsverlaufs der Trächtigkeit zu bestimmen. Die vorgestellten Daten zeigen die gleichzeitige Messung des fetalen Blutflusses und des Blutdrucks. Mit dem perivaskulären Verabreichungssystem kann eine Langzeitstudie über mehrere Tage durchgeführt werden. Weitere Anwendungen für diese Methode könnten virale Verabreichungssysteme sein, um die Expression von Genen in einem Segment der Halsschlagader zu verändern. Diese Methoden könnten sowohl auf andere Blutgefäße im wachsenden Organismus in utero als auch auf erwachsene Organismen angewendet werden.
Introduction
Die Geburt verursacht Stress für den Fötus, und es kommt zu einem erheblichen Anstieg des Katecholaminspiegels, des wichtigsten Stresshormons 1,2. Dies erhöht den systemischen Blutdruck, und wenn dieser Druck über die Halsschlagadern auf die empfindlichen Hirnkapillaren übertragen wird, kann dies zu deren Ruptur führen 3,4,5. Anstiege des systemischen Blutdrucks werden durch die Verengung der Halsschlagadern beim Vollzeitfötus daran gehindert, das Gehirn zu erreichen. Dieser Mechanismus ist jedoch beim Frühgeborenen nicht entwickelt, und dies ist für die signifikant höhere Wahrscheinlichkeit von Hirnschäden bei Frühgeborenen verantwortlich 4,5.
Derzeit gibt es keine geeignete Methode, um die Reifung der Signalwege zu untersuchen, die an der Regulierung des Karotisblutflusses mit sich entwickelnden Föten beteiligt sind. Diese Studien zum Karotisblutfluss und zur Vasoreagibilität sind sowohl aus grundlagenwissenschaftlicher als auch aus klinischer Sicht von entscheidender Bedeutung. Um die molekularen Signalwege zu bestimmen, die an der Regulation der arteriellen Kontraktilität beteiligt sind, besteht die Standardmethode derzeit darin, die arteriellen Segmente post mortem zu isolieren. Anschließend werden die Experimente mit Hilfe der Drahtmyographie durchgeführt, um die Vasokontraktilität verschiedener pharmakologischer Moleküle zu bestimmen, die die an der arteriellen Kontraktilität beteiligten Regulationswege definieren 6,7. Bemerkenswert ist, dass die Ex-vivo-Befunde aufgrund der Blutflussregulierung stromaufwärts und stromabwärts der Halsschlagader nicht in der Lage sind, die In-vivo-Umgebung vollständig zu replizieren. Daher zielte die vorliegende Studie darauf ab, eine Technik zu entwickeln, mit der die Auswirkungen von vasoresponsiven Chemikalien oder Wirkstoffen auf den Blutfluss in einer Arterie in vivo bestimmt werden können.
Die in diesem Artikel beschriebene perivaskuläre Verabreichungsmethodik bietet einen In-vivo-Ansatz , um die Wirkung der pharmakologischen oder genetischen Manipulation von Signalwegen auf verschiedene arterielle Segmente zu untersuchen. Mit dieser Methode kann man den fetalen Blutdruck und den Karotisblutfluss manipulieren. Zusätzlich werden Experimente mit Schafföten demonstriert, um die Wirkung von Signalmolekülen in einem sich entwickelnden Fötus zu untersuchen. Es bleibt zu hoffen, dass die detaillierte Methodik zu neuen Untersuchungen auf dem Gebiet der Blutflussstudien führen wird, insbesondere in Bezug auf die Physiologie und Pathologie des Fötus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Derzeit gibt es keine Methode, um die Kontraktilität und Dilatation von Gefäßen in vivo als Reaktion auf Arzneimittelverbindungen und Genmanipulation zu untersuchen. Als Standard im Feld wird der In-vivo-Blutfluss mit Doppler-Durchflusssonden, Mikrokugeln und radioaktiven Molekülen wie tritiiertem Wasser gemessen. Um jedoch die Funktionen der Rezeptoren oder die nachgeschaltete Signalübertragung zu manipulieren, werden die Tiere getötet und Experimente in vitro in Organbädern durchgefüh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Für diese Studien wurden interne Mittel der University of Arizona verwendet.
Materials
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
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