In vivo Studio in tempo reale degli effetti dei farmaci sul flusso sanguigno carotideo nel feto ovino
Summary
Il presente protocollo descrive un metodo per somministrare farmaci e agenti modificanti l’espressione genica per via perivascolare in un feto in via di sviluppo in utero . È importante sottolineare che l’effetto dei farmaci/agenti sul flusso sanguigno può essere misurato con la progressione della gravidanza.
Abstract
La capacità di un organismo di mantenere un flusso sanguigno costante al cervello in risposta a improvvisi picchi di pressione sanguigna sistemica (BP) è nota come autoregolazione cerebrale (CAR), che si verifica nell’arteria carotide. A differenza dei neonati a termine, i neonati pretermine non sono in grado di ridurre il flusso sanguigno cerebrale (CBF) in risposta all’aumento della pressione arteriosa sistemica. Nei neonati pretermine, questo espone i fragili vasi cerebrali ad alte pressioni di perfusione, portando alla loro rottura e danni cerebrali. Studi ex vivo con miografia a filo hanno dimostrato che le arterie carotidi dei feti a breve termine si restringono in risposta all’attivazione dei recettori alfa1 adrenergici. Questa risposta è attenuata nel feto pretermine. Pertanto, per esaminare il ruolo dell’alfa1-AR in vivo, viene presentato un approccio innovativo per determinare gli effetti dei farmaci su un segmento arterioso carotideo in vivo in un feto ovino durante la progressione evolutiva della gestazione. I dati presentati dimostrano la misurazione simultanea del flusso sanguigno fetale e della pressione sanguigna. Il sistema di rilascio perivascolare può essere utilizzato per condurre uno studio a lungo termine per diversi giorni. Ulteriori applicazioni per questo metodo potrebbero includere sistemi di somministrazione virale per alterare l’espressione dei geni in un segmento dell’arteria carotide. Questi metodi potrebbero essere applicati ad altri vasi sanguigni nell’organismo in crescita in utero e negli organismi adulti.
Introduction
Il parto provoca stress al feto e c’è un notevole aumento dei livelli di catecolamine, il principale ormone dello stress 1,2. Questo aumenta la pressione arteriosa sistemica e se questa pressione viene trasmessa ai fragili capillari cerebrali attraverso le arterie carotidi, questo può portare alla loro rottura 3,4,5. I picchi di pressione arteriosa sistemica sono impediti di raggiungere il cervello dalla costrizione delle arterie carotidi nel feto a termine. Tuttavia, questo meccanismo non è sviluppato nel feto pretermine, e questo è responsabile della probabilità significativamente più elevata di danni cerebrali nei feti pretermine 4,5.
Attualmente, non esiste un metodo adatto per esaminare la maturazione delle vie coinvolte nella regolazione del flusso sanguigno carotideo nei feti in via di sviluppo. Questi studi sul flusso sanguigno carotideo e sulla vasoreattività sono cruciali sia dal punto di vista scientifico di base che da quello clinico. Attualmente, per determinare le vie molecolari coinvolte nella regolazione della contrattilità arteriosa, il metodo standard prevede l’isolamento dei segmenti arteriosi post mortem. Successivamente, gli esperimenti vengono condotti utilizzando la miografia a filo per determinare la vasocontrattilità di diverse molecole farmacologiche che definiscono le vie regolatorie coinvolte nella contrattilità arteriosa 6,7. Da notare che i risultati ex vivo non sono in grado di replicare completamente l’ambiente in vivo a causa della regolazione del flusso sanguigno a monte e a valle dell’arteria carotide. Pertanto, il presente studio mirava a sviluppare una tecnica in grado di determinare gli effetti di sostanze chimiche o agenti vasoresponsivi sul flusso sanguigno in un’arteria in vivo.
La metodologia di somministrazione perivascolare descritta in questo articolo fornisce un approccio in vivo per studiare l’effetto della manipolazione farmacologica o genetica delle vie di segnalazione su diversi segmenti arteriosi. Usando questo metodo, è possibile manipolare la pressione sanguigna fetale e il flusso sanguigno carotideo. Inoltre, sono stati dimostrati esperimenti con feti di pecora per studiare gli effetti delle molecole di segnalazione in un feto in via di sviluppo. Si spera che la metodologia dettagliata fornita porti a nuove indagini nel campo degli studi sul flusso sanguigno, in particolare in relazione alla fisiologia e alla patologia fetale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Attualmente, non esiste alcun metodo per esaminare la contrattilità e la dilatazione dei vasi in vivo in risposta a composti farmacologici e manipolazione genica. Come standard nel campo, il flusso sanguigno in vivo viene misurato da sonde di flusso Doppler, microsfere e molecole radioattive come l’acqua triziata. Tuttavia, per manipolare le funzioni dei recettori o la segnalazione a valle, gli animali vengono sacrificati e vengono condotti esperimenti in vitro in bagni d’organo dopo l’isolame…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Per questi studi sono stati utilizzati fondi intramurali dell’Università dell’Arizona.
Materials
| Aaron Bovie Electrosurgical Cautery | Henry Schein, Inc | 5905974 | |
| Aaron Bovie Electrosurgical Generator | Henry Schein, Inc | 1229913 | |
| Alfalfa Pellets | Sacate Pellet Mills, Inc. Maricopa AZ | 100-80 | |
| Analog to Digital Converter | ADI Instruments | Powerlab | |
| Babcock forceps | Roboz Surgicals | RS8020 | |
| Bridge Amplifier | ADI Instruments | Bridge Amplifier | |
| Castroviejo scissors | Roboz Surgicals | RS5650SC | |
| Diazepam | Henry Schein, Inc | 1278188 | |
| Endotracheal Tube | Henry Schein, Inc | 7020408 | |
| Flow Probes | Transonic Systems Inc. | MC2PSS-JS-WC100-CRS10-GC, MC3PSS-LS-WC100-CRS10-GC | |
| Heparin | Henry Schein, Inc | 1162406 | |
| Isoflurane | Henry Schein, Inc | 1182097 | |
| Ketamine | Henry Schein, Inc | 1273383 | |
| Ketoprofen | Zoetis Inc., Kalamazoo, MI | Ketofen | |
| Manifold Pump Tubing | Fisher Scientific | 14-190-508 | |
| Metzenbaum scissors | Roboz Surgicals | RS6010 | |
| Narkomed 4 Anesthesia Machine | North American Dräger | Narkomed 4 | |
| Normal Saline | Fisher Scientific | Z1376 | |
| penicillin G procaine suspension | Henry Schein, Inc | 7455874 | |
| phenylbutazone | VetOne Boise, ID | 510226 | |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich Inc. | P1240000 | |
| Pivodine Scrub | VetOne | 510094 | Germicidal cleanser |
| PowerLab | ADInstruments | Data acquisition hardware device | |
| Pulse Oximeter | Amazon Inc. | UT100V | |
| Tygon Tubing | Fisher Scientific | ND-100-80 | |
| V-Top Surgical Table | VetLine Veterinary Classic Surgery | TSP-4010 | |
| Wound Clips | Fisher Scientific | 10-001-024 |
References
- Lagercrantz, H., Slotkin, T. A. The "stress" of being born. Scientific American. 254 (4), 100-107 (1986).
- Ronca, A. E., Abel, R. A., Ronan, P. J., Renner, K. J., Alberts, J. R. Effects of labor contractions on catecholamine release and breathing frequency in newborn rats. Behavioral Neuroscience. 120 (6), 1308-1314 (2006).
- Czynski, A., et al. Cerebral autoregulation is minimally influenced by the superior cervical ganglion in two- week-old lambs, and absent in preterm lambs immediately following delivery. PLoS One. 8 (12), e82326 (2013).
- Ballabh, P. Pathogenesis and prevention of intraventricular hemorrhage. Clinics in Perinatology. 41 (1), 47-67 (2014).
- Ballabh, P. Intraventricular hemorrhage in premature infants: Mechanism of disease. Pediatric Research. 67 (1), 1-8 (2010).
- Goyal, R., Goyal, D., Chu, N., Van Wickle, J., Longo, L. Cerebral artery alpha-1 AR subtypes: High altitude long-term acclimatization responses. PLoS One. 9 (11), e112784 (2014).
- Goyal, R., Mittal, A., Chu, N., Zhang, L., Longo, L. D. alpha(1)-Adrenergic receptor subtype function in fetal and adult cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 298 (1), H1797-H1806 (2010).
- Goyal, D., Goyal, R. Developmental maturation and alpha-1 adrenergic receptors-mediated gene expression changes in ovine middle cerebral arteries. Scientific Reports. 8 (1), 1772 (2018).
- Goyal, R., et al. Maturation and the role of PKC-mediated contractility in ovine cerebral arteries. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 297 (6), H2242-H2252 (2009).
- Gratton, R., Carmichael, L., Homan, J., Richardson, B. Carotid arterial blood flow in the ovine fetus as a continuous measure of cerebral blood flow. Journal of the Society for Gynecologic Investigation. 3 (2), 60-65 (1996).
- Bishai, J. M., Blood, A. B., Hunter, C. J., Longo, L. D., Power, G. G. Fetal lamb cerebral blood flow (CBF) and oxygen tensions during hypoxia: a comparison of laser Doppler and microsphere measurements of CBF. Journal of Physiology. 546, 869-878 (2003).
- Ashwal, S., Dale, P. S., Longo, L. D. Regional cerebral blood flow: studies in the fetal lamb during hypoxia, hypercapnia, acidosis, and hypotension). Pediatric Research. 18 (12), 1309-1316 (1984).
