Визуализация живых клеток неповрежденных глобусов Ex Vivo с использованием нового 3D-печатного держателя
Summary
Настоящая работа описывает новый экспериментальный протокол, который использует 3D-печатный держатель для обеспечения визуализации живых клеток с высоким разрешением энуклеированных глобусов. Благодаря этому протоколу клеточная сигнальная активность кальция в раненом эпителии роговицы из глобусов ex vivo может наблюдаться в режиме реального времени.
Abstract
Заживление эпителиальной раны роговицы – это миграционный процесс, инициируемый активацией пуринергических рецепторов, экспрессируемых на эпителиальных клетках. Эта активация приводит к событиям мобилизации кальция, которые распространяются от клетки к клетке, которые необходимы для инициирования клеточной подвижности в раневом слое, способствуя эффективному заживлению ран. Лаборатория Тринкауса-Рэндалла разработала методологию визуализации реакции заживления ран роговицы в шарах мышей ex vivo в режиме реального времени. Этот подход включает в себя энуклеацию неповрежденного глобуса от мыши, которая была усыплена в соответствии с установленными протоколами, и немедленную инкубацию земного шара с помощью индикаторного красителя кальция. На этом этапе может быть применено встречное пятно, которое окрашивает другие особенности клетки, чтобы помочь с визуализацией и показать клеточные ориентиры. Протокол хорошо работал с несколькими различными красителями живых клеток, используемыми для контрокраширования, включая Актин SiR для окрашивания актина и темно-красное окрашивание плазматической мембраны для окрашивания клеточной мембраны. Чтобы исследовать реакцию на рану, эпителий роговицы повреждается с помощью иглы 25 G, а глобусы помещаются в 3D-печатный держатель. Размеры 3D-печатного держателя калибруются для обеспечения иммобилизации земного шара на протяжении всего эксперимента и могут быть изменены для размещения глаз разных размеров. Визуализация реакции раны живыми клетками выполняется непрерывно на различных глубинах по всей ткани с течением времени с использованием конфокальной микроскопии. Этот протокол позволяет нам генерировать изображения с высоким разрешением и качеством публикации с использованием 20-кратного воздушного объектива на конфокальном микроскопе. Другие цели также могут быть использованы для этого протокола. Он представляет собой значительное улучшение качества визуализации живых клеток в шарах мышей ex vivo и позволяет идентифицировать нервы и эпителий.
Introduction
Роговица
Роговица представляет собой четкую, аваскулярную структуру, покрывающую переднюю поверхность глаза, которая преломляет свет, чтобы обеспечить зрение и защищает внутреннюю часть глаза от повреждений. Поскольку роговица подвергается воздействию окружающей среды, она подвержена повреждениям как от механических причин (царапины), так и от инфекции. Травма роговицы у здорового пациента обычно заживает в течение 1-3 дней. Однако у пациентов с основными состояниями, включая дефицит лимбальных стволовых клеток и диабет II типа, процесс заживления ран роговицы может быть значительно продлен1. Поскольку роговица сильно иннервируется, эти незаживающие язвы роговицы и рецидивирующие эрозии роговицы очень болезненны и значительно снижают качество жизни пациентов, испытывающих их1.
Передача сигналов сотовой связи
Когда в противном случае здоровая роговица повреждена, сигнальные события кальция в клетках, прилегающих к ране, предшествуют и вызывают клеточную миграцию в раневое ложе, где они закрывают травму без риска рубцевания 2,3. Эти сигнальные события были хорошо охарактеризованы в моделях культур эпителиальных клеток роговицы с использованием визуализации живых клеток2. Предварительные эксперименты демонстрируют значительно большую передачу сигналов кальция после травмы в недиабетических клетках по сравнению с диабетическими клетками. Однако характеристика событий передачи сигналов клетками в глобусах ex vivo оказалась технической проблемой.
Визуализация живых клеток
Предыдущие исследования успешно регистрировали сигнальные события кальция из моделей посева клеток in vitro заживления ран роговицы 4,5,6. Разработка методологии для получения высококачественных изображений этих сигнальных событий в ткани ex vivo представляет большой интерес, поскольку она позволила бы изучать эти события в более сложной и реалистичной системе. Предыдущие подходы включали рассечение роговицы с последующей иммобилизацией в УФ-индуцированном геле PEG 7,8,9. Иммобилизация является важным, но сложным шагом при работе с живой тканью, поскольку она должна оставаться жизнеспособной и гидратированной на протяжении всего эксперимента. Кроме того, иммобилизация не должна повреждать ткани. В то время как раствор PEG обездвиживал ткань, разрешение и качество полученных изображений не были последовательными. Поэтому были разработаны 3D-печатные держатели для иммобилизации неповрежденных глобусов для получения изображений более высокого качества с меньшим риском повреждения тканей.
Подход
Уникальный 3D-печатный держатель был разработан для иммобилизации неповрежденных глобусов ex vivo для визуализации живых клеток. Этот держатель предотвращает повреждение от двух основных источников: он позволяет визуализировать энуклеированный глобус без необходимости рассечения роговицы и исключает воздействие ультрафиолетового света. Без этих источников повреждений полученные изображения более точно представляли реакцию на царапины, сделанные экспериментально. Кроме того, держатель для 3D-печати был откалиброван в соответствии с точными размерами мышиного глаза. Это обеспечило гораздо лучшую посадку, чем иммобилизация в растворе ПЭГ, что привело к более высокому качеству изображения при более мощных объективах из-за уменьшения движения тканей. Крышка, прикрепленная к верхней части держателя, гарантирует, что глобус остается неподвижным на протяжении всего эксперимента и что при применении питательных сред для поддержания гидратации и жизнеспособности не происходит смещения земного шара. Возможность печати держателя до точных размеров также позволяет нам генерировать оптимальную посадку для мышиных глаз разных размеров из-за возраста или статуса заболевания. Эта технология может быть применена более широко для разработки держателей для глаз различных видов на основе их размеров.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описывает метод визуализации живых клеток, который использует 3D-печатный держатель для стабилизации и обездвиживания неповрежденных глаз животных. Он предназначен для обхода нескольких существенных недостатков, признанных предыдущими протоколами визуализации живых к…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить NIH за следующую грантовую поддержку: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) и 5T32GM008541-24 (KS). Мы также хотели бы отметить Массачусетский фонд исследований глаз львов и Фонд трансплантации роговицы Новой Англии.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
