Yeni Bir 3D Baskılı Tutucu Kullanarak Bozulmamış Ex Vivo Kürelerin Canlı Hücre Görüntülemesi
Summary
Bu çalışma, enüklee edilmiş kürelerin yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemesini sağlamak için 3D baskılı bir tutucu kullanan yeni bir deneysel protokolü açıklamaktadır. Bu protokol sayesinde, ex vivo kürelerden yaralı kornea epitelindeki hücresel kalsiyum sinyal aktivitesi gerçek zamanlı olarak gözlemlenebilir.
Abstract
Kornea epitelyal yara iyileşmesi, epitel hücrelerinde eksprese edilen pürinerjik reseptörlerin aktivasyonu ile başlayan bir göç sürecidir. Bu aktivasyon, hücreden hücreye yayılan, yara yatağına hücresel hareketliliği başlatmak için gerekli olan ve etkili yara iyileşmesini teşvik eden kalsiyum mobilizasyon olaylarıyla sonuçlanır. Trinkaus-Randall laboratuvarı, ex vivo murin kürelerinde kornea yarasının iyileşme yanıtını gerçek zamanlı olarak görüntülemek için bir metodoloji geliştirdi. Bu yaklaşım, sağlam bir küreyi, belirlenmiş protokollere göre ötenazi yapılmış bir fareden çekirdeksizleştirmeyi ve dünyayı derhal bir kalsiyum gösterge boyası ile inkübe etmeyi içerir. Hücrenin diğer özelliklerini lekeleyen bir karşı boya, görüntülemeye yardımcı olmak ve hücresel yer işaretlerini göstermek için bu aşamada uygulanabilir. Protokol, aktini boyamak için SiR aktinini ve hücre zarını boyamak için koyu kırmızı plazma zarı boyası da dahil olmak üzere karşı boyama için kullanılan birkaç farklı canlı hücre boyasıyla iyi çalıştı. Bir yaraya verilen cevabı incelemek için, kornea epiteli 25 G’lik bir iğne kullanılarak yaralanır ve küreler 3D baskılı bir tutucuya yerleştirilir. 3D baskılı tutucunun boyutları, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını sağlamak için kalibre edilir ve farklı boyutlardaki gözlere uyacak şekilde değiştirilebilir. Yara yanıtının canlı hücre görüntülemesi, konfokal mikroskopi kullanılarak zaman içinde doku boyunca çeşitli derinliklerde sürekli olarak gerçekleştirilir. Bu protokol, konfokal mikroskopta 20x hava hedefi kullanarak yüksek çözünürlüklü, yayın kalitesinde görüntüler üretmemizi sağlar. Bu protokol için başka hedefler de kullanılabilir. Ex vivo murin kürelerde canlı hücre görüntüleme kalitesinde önemli bir iyileşmeyi temsil eder ve sinirlerin ve epitelin tanımlanmasına izin verir.
Introduction
Kornea
Kornea gözün ön yüzeyini kaplayan, görmeyi sağlamak için ışığı kıran ve gözün içini hasardan koruyan berrak, avasküler bir yapıdır. Kornea çevreye maruz kaldığından, hem mekanik nedenlerden (çizilme) hem de enfeksiyondan kaynaklanan hasarlara karşı hassastır. Aksi takdirde sağlıklı bir hastada kornea yaralanması tipik olarak 1-3 gün içinde iyileşir. Bununla birlikte, limbal kök hücre eksikliği ve tip II diyabet gibi altta yatan koşulları olan hastalarda, kornea yarası iyileşme süreci büyük ölçüde uzayabilir1. Kornea oldukça innervatlı olduğundan, bu iyileşmeyen kornea ülserleri ve tekrarlayan kornea erozyonları çok ağrılıdır ve bunları yaşayan hastaların yaşam kalitesini büyük ölçüde azaltır1.
Hücre sinyalizasyonu
Aksi takdirde sağlıklı bir kornea yaralandığında, yaraya bitişik hücrelerdeki kalsiyum sinyal olayları, yara yatağına hücresel göçten önce gelir ve hızlı bir şekilde göç eder, buradayara izi 2,3 riski olmadan yaralanmayı kapatırlar. Bu sinyal olayları, canlı hücre görüntüleme2 kullanılarak kornea epitel hücre kültürü modellerinde iyi karakterize edilmiştir. Ön deneyler, diyabetik olmayan hücrelerde yaralanma sonrası diyabetik hücrelere kıyasla önemli ölçüde daha fazla kalsiyum sinyallemesi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, ex vivo kürelerdeki hücre sinyal olaylarının karakterizasyonunun teknik bir zorluk olduğu kanıtlanmıştır.
Canlı hücre görüntüleme
Önceki çalışmalar, kornea yara iyileşmesinin in vitro hücre kültürü modellerinden kalsiyum sinyal olaylarını başarıyla kaydetmiştir 4,5,6. Bu sinyal olaylarının ex vivo dokuda yüksek kaliteli görüntülerini üretmek için bir metodoloji geliştirmek büyük ilgi çekicidir, çünkü bu olayların daha karmaşık ve gerçekçi bir sistemde incelenmesine izin verecektir. Önceki yaklaşımlar korneanın diseksiyonunu ve ardından UV kaynaklı PEG jeli 7,8,9’da immobilizasyonu içeriyordu. İmmobilizasyon, canlı doku ile çalışırken önemli ama zorlu bir adımdır, çünkü deney boyunca canlı ve hidratlı kalması gerekir. Ayrıca, immobilizasyon dokuya zarar vermemelidir. PEG çözeltisi dokuyu hareketsiz hale getirirken, üretilen görüntülerin çözünürlüğü ve kalitesi tutarlı değildi. Bu nedenle, daha az doku hasarı riski taşıyan daha yüksek kaliteli görüntüler üretmek için bozulmamış küreleri hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı tutucular geliştirilmiştir.
Yaklaşım
Canlı hücre görüntüleme için bozulmamış ex vivo küreleri hareketsiz hale getirmek için benzersiz bir 3D baskılı tutucu geliştirilmiştir. Bu tutucu iki ana kaynaktan gelen hasarı önler: korneayı diseke etmeye gerek kalmadan enüklee edilmiş bir kürenin görüntülenmesini sağlar ve UV ışığına maruz kalmayı ortadan kaldırır. Bu hasar kaynakları olmadan, elde edilen görüntüler deneysel olarak yapılan çizik yaralanmalarına verilen cevabı daha doğru bir şekilde temsil ediyordu. Ayrıca, 3D baskılı tutucu, murin gözünün hassas boyutlarına göre kalibre edildi. Bu, PEG çözeltisinde immobilizasyondan çok daha iyi bir uyum sağladı ve doku hareketinin azalması nedeniyle daha düşük güçlü hedeflerde daha yüksek kaliteli bir görüntüye yol açtı. Tutucunun üst kısmına tutturulmuş bir kapak çubuğu, deney süresince dünyanın hareketsiz kalmasını ve hidrasyon ve canlılığı korumak için büyüme ortamı uygulandığında dünyanın yer değiştirmemesini sağlar. Tutucuyu hassas boyutlara basma yeteneği, yaş veya hastalık durumu nedeniyle farklı boyutlardaki murin gözleri için en uygun uyumu sağlamamızı sağlar. Bu teknoloji, boyutlarına göre farklı türlerin gözleri için tutucular geliştirmek için daha geniş çapta uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bozulmamış hayvan gözlerini stabilize etmek ve hareketsiz hale getirmek için 3D baskılı bir tutucu kullanan canlı bir hücre görüntüleme tekniğini tanımlar. Ex vivo kornea dokusunun önceki canlı hücre görüntüleme protokolleri ile tanınan birkaç önemli dezavantajı atlatmak için tasarlanmıştır. Bu protokol, bozulmamış kürelerin canlı hücre görüntülemesi için birçok avantaj sunar. Deneysel olarak indüklenen çizik yaralarına yara iyileşmesi tepkisine müdahale ede…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH’ye aşağıdaki hibe desteği için teşekkür ederiz: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ve 5T32GM008541-24 (KS). Ayrıca Massachusetts Lions Göz Araştırma Fonu ve New England Kornea Nakli Fonu’na da teşekkür ederiz.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
