הדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמים של Ex Vivo באמצעות מחזיק חדשני מודפס בתלת-ממד
Summary
העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול ניסיוני חדשני המשתמש במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לאפשר הדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה של גלובוסים דחוסים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לצפות בפעילות איתות הסידן התאי באפיתל קרנית פצועה מגלובוסים ex vivo בזמן אמת.
Abstract
ריפוי פצעי אפיתל בקרנית הוא תהליך נדידה היזום על ידי הפעלת קולטנים פורינרגיים המתבטאים בתאי אפיתל. הפעלה זו גורמת לאירועי גיוס סידן המתפשטים מתא לתא, החיוניים לייזום תנועתיות תאית לתוך מיטת הפצע, ומקדמים ריפוי פצעים יעיל. מעבדת טרינקאוס-רנדל פיתחה מתודולוגיה להדמיית תגובת ריפוי פצעי הקרנית בגלובוסים ex vivo murine בזמן אמת. גישה זו כוללת הרטבת גלובוס שלם מעכבר שעבר המתת חסד על פי פרוטוקולים שנקבעו ומיד דגירה של כדור הארץ באמצעות צבע מחוון סידן. בשלב זה ניתן ליישם כתם נגדי שמכתים תכונות אחרות של התא כדי לסייע בהדמיה ולהראות ציוני דרך תאיים. הפרוטוקול עבד היטב עם מספר צבעים שונים של תאים חיים המשמשים להכתמה נגדית, כולל אקטין SiR לצביעת אקטין וכתם קרום פלזמה אדום עמוק כדי להכתים את קרום התא. כדי לבחון את התגובה לפצע, אפיתל הקרנית נפגע באמצעות מחט 25 גרם, והגלובוסים ממוקמים במחזיק מודפס בתלת מימד. הממדים של המחזיק המודפס בתלת-ממד מכוילים כדי להבטיח אימוביליזציה של כדור הארץ לאורך כל משך הניסוי, וניתן לשנותם כך שיתאימו לעיניים בגדלים שונים. הדמיית תאים חיים של תגובת הפצע מבוצעת באופן רציף בעומקים שונים ברחבי הרקמה לאורך זמן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. פרוטוקול זה מאפשר לנו להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה ובאיכות פרסום באמצעות מטרה אווירית של פי 20 במיקרוסקופ קונפוקלי. מטרות אחרות יכולות לשמש גם עבור פרוטוקול זה. הוא מייצג שיפור משמעותי באיכות הדמיית התאים החיים בגלובוסים ex vivo murine ומאפשר זיהוי של עצבים ואפיתל.
Introduction
קרנית
הקרנית היא מבנה שקוף ואווסקולרי המכסה את המשטח הקדמי של העין אשר שובר את האור כדי לאפשר ראייה ומגן על פנים העין מפני נזק. מכיוון שהקרנית חשופה לסביבה, היא רגישה לנזקים הן מסיבות מכניות (גירוד) והן מזיהום. פגיעה בקרנית אצל חולה בריא בדרך כלל מחלימה תוך 1-3 ימים. עם זאת, בחולים עם מחלות רקע, כולל מחסור בתאי גזע לימבליים וסוכרת מסוג II, תהליך הריפוי של פצעי הקרנית יכול להיות ממושך מאוד1. מכיוון שהקרנית מאוד מופנמת, כיבים אלה שאינם מרפאים את הקרנית ושחיקות חוזרות ונשנות של הקרנית כואבים מאוד ופוגעים מאוד באיכות החיים של המטופלים החווים אותם1.
איתות תאי
כאשר קרנית בריאה נפגעת, אירועי איתות סידן בתאים הסמוכים לפצע מקדימים וגורמים לנדידה תאית לתוך מיטת הפצע, שם הם סוגרים את הפציעה ללא סיכון של הצטלקות 2,3. אירועי איתות אלה אופיינו היטב במודלים של תרביות תאי אפיתל בקרנית באמצעות הדמיית תאים חיים2. ניסויים ראשוניים הדגימו איתות סידן גבוה יותר באופן משמעותי לאחר פציעה בתאים שאינם סוכרתיים בהשוואה לתאים סוכרתיים. עם זאת, אפיון אירועי האיתות הסלולרי בגלובוסים ex vivo התגלה כאתגר טכני.
הדמיית תאים חיים
מחקרים קודמים תיעדו בהצלחה אירועי איתות סידן ממודלים של תרביות תאים במבחנה של ריפוי פצעי בקרנית 4,5,6. פיתוח מתודולוגיה להפקת תמונות באיכות גבוהה של אירועי איתות אלה ברקמת ex vivo הוא עניין רב מכיוון שהוא יאפשר לחקור אירועים אלה במערכת מורכבת ונאמנה יותר לחיים. גישות קודמות כללו כריתה של הקרנית ואחריה אימוביליזציה בג’ל PEGהמושרה על ידי UV 7,8,9. אימוביליזציה היא צעד חיוני אך מאתגר בעבודה עם רקמות חיות, מכיוון שהיא חייבת להישאר בת קיימא ולחות לאורך כל הניסוי. יתר על כן, אסור שאימוביליזציה תפגע ברקמה. בעוד שתמיסת PEG שיתקה את הרקמה, הרזולוציה והאיכות של התמונות שהופקו לא היו עקביות. לכן, מחזיקי הדפסה בתלת-ממד פותחו כדי לשתק גלובוסים שלמים כדי להפיק תמונות באיכות גבוהה יותר עם פחות סיכון לנזק לרקמות.
הגישה
מחזיק ייחודי המודפס בתלת-ממד פותח כדי לשתק גלובוסים שלמים של ex vivo להדמיית תאים חיים. מחזיק זה מונע נזק משני מקורות עיקריים: הוא מאפשר הדמיה של כדור הארץ ללא צורך לנתח את הקרנית, והוא מבטל את החשיפה לאור UV. ללא מקורות נזק אלה, התמונות שהתקבלו ייצגו בצורה מדויקת יותר את התגובה לפציעות השריטות שנעשו בניסוי. יתר על כן, המחזיק שהודפס בתלת-ממד כויל לממדים המדויקים של עין המורין. זה סיפק התאמה טובה בהרבה מאשר אימוביליזציה בפתרון PEG, מה שהוביל לתמונה באיכות גבוהה יותר ביעדים בעלי עוצמה נמוכה יותר עקב ירידה בתנועת הרקמות. פס כיסוי המחובר לחלק העליון של המחזיק מבטיח כי הגלובוס נשאר ללא תנועה לאורך כל משך הניסוי וכי אין תזוזה של הגלובוס כאשר מדיית הצמיחה מוחלת כדי לשמור על הידרציה וכדאיות. היכולת להדפיס את המחזיק למידות מדויקות מאפשרת לנו גם לייצר התאמה אופטימלית לעיניים מורין בגדלים שונים בשל הגיל או מצב המחלה. טכנולוגיה זו יכולה להיות מיושמת באופן רחב יותר כדי לפתח מחזיקים לעיניים של מינים שונים בהתבסס על מידותיהם.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה של תאים חיים המשתמשת במחזיק מודפס בתלת-ממד כדי לייצב ולשתק עיניים שלמות של בעלי חיים. הוא נועד לעקוף מספר חסרונות משמעותיים המוכרים בפרוטוקולי הדמיה קודמים של תאים חיים של רקמת קרנית ex vivo . פרוטוקול זה מציע יתרונות רבים להדמיית תאים חיים של גלובוסים שלמי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות ל-NIH על תמיכת המענק הבאה: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) ו-5T32GM008541-24 (KS). ברצוננו להודות גם לקרן לחקר העיניים של אריות מסצ’וסטס ולקרן השתלות הקרנית של ניו אינגלנד.
Materials
| 1.75 blue polylactic acid (PLA) plastic | Creality (Shenzen, China) | N/A | Material for holder |
| 35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 14 mm glass diameter, Poly-D-Lysine Coated | MatTek Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1.5-14-C | Well for imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software used for printing the holders. |
| BD 25 G 7/8 sterile needles single use 100 needles/box | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | For experimentally-induced wounds to the globes |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Cell membrane counterstain. Calcium indicator. 1:10,000 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | For attaching the holder to the imaging well |
| Ender 3 Pro 3D printer | Creality (Shenzen, China) | N/A | For printing the holder |
| FIJI/ImageJ | ImageJ (Bethesda, MD) | License Number: GPL2 | Softwareused for confirming consistency of wound depth and diameter between independent globes using Region of Interest analysis |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Calcium indicator. 1:100 concentration with a final concentration of 1%(v/v) DMSO and 0.1% (w/v) pluronic acid |
| Keratinocyte Serum-Free Medium | Gibco (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL bovine pituitary extract, 0.02 nM EGF, 0.3 mM CaCl2, and penicillin-streptomycin (100 units/mL, 100 µg/mL, respectively) added to medium |
| Phophate-Buffered Saline (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Used to wash excess stain off of corneas before imaging |
| Zeiss Confocal 880 Microscope with AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A | 20x magnification objective was used |
References
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al. Sustained Ca2+ mobilizations: A quantitative approach to predict their importance in cell-cell communication and wound healing. PLoS One. 14 (4), 0213422 (2019).
- Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121, 178-193 (2014).
- Klepeis, V. S., Cornell-Bell, A., Trinkaus-Randal, V. Growth factors but not gap junctions play a role in injury-induced Ca2+ waves in epithelial cells. Journal of Cell Science. 114 (23), 4185-4195 (2001).
- Lee, A., et al. Hypoxia-induced changes in Ca(2+) mobilization and protein phosphorylation implicated in impaired wound healing. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 306 (10), 972-985 (2014).
- Boucher, I., Rich, C., Lee, A., Marcincin, A., Trinkaus-Randall, V. The P2Y2 receptor mediates the epithelial injury response and cell migration. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 299 (2), 411-421 (2010).
- Awal, M. R., Wirak, G. S., Gabel, C. V., Connor, C. W. Collapse of global neuronal states in Caenorhabditis elegans under isoflurane anesthesia. Anesthesiology. 133 (1), 133-144 (2020).
- Burnett, K., Edsinger, E., Albrecht, D. R. Rapid and gentle hydrogel encapsulation of living organisms enables long-term microscopy over multiple hours. Communications Biology. 1, 73 (2018).
- Rhodes, G., et al. Pannexin1: Role as a sensor to injury is attenuated in pretype 2 corneal diabetic epithelium. Analytical Cellular Pathology. 2021, 4793338 (2021).
- Segars, K. L., et al. Age dependent changes in corneal epithelial cell signaling. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 886721 (2022).
- Xu, P., Londregan, A., Rich, C., Trinkaus-Randall, V. Changes in epithelial and stromal corneal stiffness occur with age and obesity. Bioengineering. 7 (1), 14 (2020).
- Minns, M. S., Teicher, G., Rich, C. B., Trinkaus-Randall, V. Purinoreceptor P2X7 regulation of Ca(2+) mobilization and cytoskeletal rearrangement is required for corneal reepithelialization after injury. The American Journal of Pathology. 186 (2), 285-296 (2016).
- Tadvalkar, G., Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Stepp, M. A. The impact of euthanasia and enucleation on mouse corneal epithelial axon density and nerve terminal morphology. The Ocular Surface. 18 (4), 821-828 (2020).
