新しい3Dプリントホルダーを使用した無傷の ex vivo グローブの生細胞イメージング

角膜
角膜は、目の前面を覆う透明な無血管構造であり、光を屈折させて視力を可能にし、目の内部を損傷から保護します。角膜は環境にさらされているため、機械的原因(引っかき傷)と感染の両方による損傷を受けやすくなります。他の点では健康な患者の角膜損傷は、通常1〜3日以内に治癒します。しかし、辺縁系幹細胞欠損症やII型糖尿病などの基礎疾患のある患者では、角膜創傷治癒プロセスを大幅に延長することができます¹。角膜は高度に神経支配されているため、これらの非治癒性の角膜潰瘍と再発性角膜びらんは非常に痛みを伴い、それらを経験している患者の生活の質を大幅に低下させます¹。

細胞シグナル伝達
他の点では健康な角膜が損傷すると、創傷に隣接する細胞内のカルシウムシグナル伝達イベントが先行し、創傷床への細胞移動を促し、そこで瘢痕化のリスクなしに損傷を閉じます^2,3。これらのシグナル伝達イベントは、ライブセルイメージングを用いた角膜上皮細胞培養モデルで十分に特徴付けられています²。予備実験は、糖尿病細胞と比較して、非糖尿病細胞における傷害後の有意に多くのカルシウムシグナル伝達を実証する。しかしながら、ex vivoグローブにおける細胞シグナル伝達事象の特性評価は、技術的な課題であることが証明されている。

ライブセルイメージング
以前の研究では、角膜創傷治癒のin vitro細胞培養モデルからのカルシウムシグナル伝達イベントを記録することに成功しています^4、5、6。ex vivo組織におけるこれらのシグナル伝達事象の高品質の画像を生成する方法論を開発することは、より複雑で現実的なシステムでこれらの事象の研究を可能にするため、非常に興味深いものである。以前のアプローチは、角膜の解剖とそれに続くUV誘発PEGゲルへの固定化を含んでいた⁷、^8、9。固定化は、実験の過程を通して生存可能で水和されたままでなければならないため、生きた組織を扱う際に不可欠でありながら困難なステップです。さらに、固定化は組織を傷つけてはならない。PEG溶液は組織を固定化しましたが、生成された画像の解像度と品質は一貫していませんでした。そのため、3Dプリントホルダーは、無傷の地球儀を固定して、組織の損傷のリスクが少なく高品質の画像を生成するために開発されました。

アプローチ
生細胞イメージングのために無傷の ex vivo グローブを固定化するために、独自の3Dプリントホルダーが開発されました。このホルダーは、角膜を解剖することなく除核球体のイメージングを可能にし、紫外線への曝露を排除するという2つの主要な光源からの損傷を防ぎます。これらの損傷源がなければ、得られた画像は、実験的に行われた引っかき傷に対する反応をより正確に表した。さらに、3Dプリントされたホルダーは、マウスアイの正確な寸法に合わせてキャリブレーションされました。これにより、PEG溶液での固定よりもはるかに優れたフィット感が得られ、組織の動きが減少するため、低出力の対物レンズでより高品質の画像が得られます。ホルダーの上部に取り付けられたカバーバーは、実験期間中、グローブが動かないままであり、水分補給と生存能力を維持するために成長培地が適用されたときにグローブが変位しないようにします。ホルダーを正確な寸法に印刷する機能により、年齢や病気の状態に応じてさまざまなサイズのマウスの目に最適なフィット感を生成することもできます。この技術は、寸法に基づいて異なる種の目のホルダーを開発するために、より広く適用することができます。