Düşük Bolluktaki Proteinlerin Hedeflenen Kütle Spektrometrisine Dayalı Protein Analizinde Mikro Örnekleme

Standart çözeltilerin hazırlanmasında sağlıklı kan donörlerinden serum kullanılmıştır. Sağlıklı kan bağışçılarından serum kullanımı, Norveç yasalarına sıkı sıkıya bağlı olarak gerçekleştirildi. Tüm deneklerden bilgilendirilmiş onam alındı. Serum örnekleri, ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun yöntemler kullanılarak analiz edildi. Açıklanan protokol, önceki çalışma14’te açıklanan yöntemin değiştirilmiş bir sürümüdür. Tamponların ve çözeltilerin bileşimine ve bunların nasıl hazırlanacağına genel bir bakış Ek Tablo S1’de bulunabilirken, Malzeme Tablosu bu protokolde kullanılan malzemeleri, ekipmanları ve reaktifleri içerir. 1. Antikor kaplı manyetik boncukların hazırlanması İstenilen sayıda boncuk hazırlamak için gerekli antikor miktarını hesaplayın. 50 mg manyetik boncuk başına 1 mg antikor kullanın.NOT: Tipik olarak, sonraki deneylerde numune başına 20 mg / mL boncuk süspansiyonunun 20 μL’si kullanılır (bkz. adım 5.1). İstenilen sayıda boncuk hazırlamak için gerekli antikor hacmini hesaplayın.NOT: Antikor hacmi antikor konsantrasyonuna bağlıdır ve her antikor için hesaplanması gerekir. İstenilen miktarda antikor çözeltisini 5 mL’lik düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Örnek olarak, antikor çözeltisi 1 mg / mL antikor içeriyorsa, 1.0 mL boncuk süspansiyonu hazırlamak için 0.4 mL kullanın (1 mg antikor / 50 mg boncuk ile 20 mg boncuk / mL).NOT: Antikorlar amin içermeyen bir tamponda olmalıdır. Adsorpsiyon nedeniyle analit kaybını önlemek için protein içeren tüm çözeltiler için düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri kullanın. Antikor çözeltisine küçük bir manyetik karıştırma çubuğu ekleyin ve sürekli karıştırma altında pH’ı 2,5’e ayarlayın. PH’ı ölçmek için mikro elektrotlu bir pH metre kullanın ve tanımlanmış 1,0 M HCl hacimlerinin kademeli olarak eklenmesiyle pH’ı ayarlayın (1,0 M HCl’lik 10 μL kısım ekleyerek başlayın ve pH 2,5’e yaklaştıkça hacmi azaltın). PH’ı 2,5’e ayarlamak için gereken toplam 1,0 M HCl hacmini kaydedin. Mikro elektrodu çıkarın ve asitlenmiş antikoru buz üzerinde manyetik bir karıştırıcı üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin.NOT: Antikorun asit muamelesi, antikorların boncuk üzerindeki doğru oryantasyonunu teşvik etmek için yapılır. HCl konsantrasyonu, antikor çözeltisindeki tampon konsantrasyonuna bağlı olarak 0,5 M veya 0,2 M HCl’ye düşürülebilir. Antikor çözeltisini nötralize edin. PH’ı ölçmek için mikro elektrotlu bir pH metre kullanın ve tanımlanmış 1,0 M NaOH hacimlerinin kademeli olarak eklenmesiyle pH’ı 7’ye ayarlayın (10 μL’lik bir kısımla başlayın ve pH 7’ye yaklaştıkça hacmi azaltın). Eklenen toplam 1,0 M NaOH hacmini kaydedin.NOT: NaOH konsantrasyonu, adım 1.4’te kullanılan HCl konsantrasyonu ile aynı olmalıdır. NaOH oldukça aşındırıcıdır; Eldiven ve uygun göz koruması dahil olmak üzere koruyucu ekipman kullanın. Kullanılacak tosil aktif manyetik boncukların istenen hacmini hesaplayın.NOT: Tipik olarak, küçük ölçekli bağlantı yaparken 20 mg boncuk/mL kullanılması önerilir. En az 5 mg boncuk kullanılmalıdır. Manyetik boncuk süspansiyonunu bir vorteks karıştırıcı üzerinde iyice karıştırın ve istenen miktarda boncuk süspansiyonu içeren bir hacmi geri çekin. Örnek olarak, 1 mL boncuk süspansiyonu hazırlamak için, 20 mg boncuk içeren bir hacmi geri çekin (boncukların konsantrasyonu 30 mg / mL ise 667 μL). Boncuk süspansiyonunu 1 dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları eşit hacimde Tip 1 H2O ile 2x yıkayın (1 mL 20 mg/mL antikor kaplı boncuk hazırlamak için 30 mg/mL boncuk çözeltisi kullanılırsa 667 μL). Her yıkama çözeltisi ilavesinden sonra bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın ve süpernatanı çıkarmadan önce manyetik rafa 1 dakika bekletin. Manyetik boncuklara aşağıdakileri ekleyin: asitle muamele edilmiş antikor, 0.5 M borat tamponu (pH 9.5) (nihai konsantrasyon 0.1 M olmalıdır; bu, 1 mL boncuk süspansiyonu hazırlamak için 0.2 mL’ye eşittir) ve antikor kuplajı için kuplajlama tamponu (1 mL antikor kaplı manyetik boncuk hazırlamak için, bağlantı tamponunun hacmi 1 mL’ye eşit olmalıdır – asitle muamele edilmiş antikor hacmi – 0.2 mL borat tamponu). Bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın.NOT: Asitle muamele edilmiş antikorun hacmi, antikor çözeltisinin hacmine eşittir (1 mg/mL antikor çözeltisi kullanılarak 1 mL boncuk süspansiyonunun hazırlanmasında 0,4 mL) + pH’ı 2,5’e ayarlamak için kullanılan 1,0 M HCl hacmi + pH’ı 7’ye ayarlamak için kullanılan 1,0 M NaOH hacmi).NOT: Antikor kuplajları için 0,5 M borat tamponu (pH 9,5) ve kuplaj tamponunun bileşimi Ek Tablo S1’de bulunabilir. Uçtan uca bir numune mikseri kullanarak, tercihen karşılıklı dönüş ve titreşimle gece boyunca ortam sıcaklığında döndürün. 239 × g’da 10 dakika boyunca santrifüj. Tüpü mıknatısın üzerine 2 dakika boyunca yerleştirin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları 2 x 2 saat ve bir kez gece boyunca, uçtan uca bir numune mikseri kullanarak ortam sıcaklığında antikor boncukları için depolama tamponunda döndürerek yıkayın. Adım 1.10’da toplam disk bölümüyle aynı disk bölümünü kullanın. Tüpü mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve her yıkama arasında süpernatantı çıkarın.NOT: Antikor boncukları için depolama tamponunun bileşimi Ek Tablo S1’de bulunabilir. İstenilen boncuk stok konsantrasyonunu (tipik olarak 20 mg/mL) kullanarak istenen tamponda (örneğin, adım 1.13’teki ile aynı tamponda) saklayın. Buzdolabında saklayın. 2. 2 mL tripsin immobilize boncuk hazırlanması (20 mg/mL boncuklar) Boncukları yıkamak için 2 mL NHS ile aktive edilmiş agaroz boncuklarına 20 mL 1 mM HCl ekleyin. 5 dakika boyunca 2.655 × g’da karıştırın ve santrifüj edin. Supernatan’ı çıkarın. 20 mL 0,1 M fosfat tamponu (pH 7,8) ekleyin. Bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın ve 5 dakika boyunca 2.655 × g’da santrifüj yapın. Supernatan’ı çıkarın.NOT: 0,1 M fosfat tamponunun (pH 7,8) bileşimi Ek Tablo S1’de bulunabilir. 2 mL 20 mg/mL tripsin ekleyin (tripsin kuplajları için soğuk bağlantı tamponunda çözülür).NOT: Tripsin kuplajı için kuplaj tamponunun bileşimi Ek Tablo S1’de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın. Sıcaklık kontrollü bir mikser kullanarak 22 ° C’de ve 1.100 rpm’de 25 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g’da santrifüj. Supernatan’ı çıkarın. Tripsin boncuklarının hazırlanması için 2 mL modifikasyon tamponu ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı kullanarak 22 ° C’de ve 1.100 rpm’de 20 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g’da santrifüj. Supernatan’ı çıkarın.NOT: Tripsin boncuklarının hazırlanması için modifikasyon tamponunun bileşimi Ek Tablo S1’de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın. Tripsin boncuklarının hazırlanması için 10 mL bloke edici tampon ekleyin ve sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı kullanarak 22 ° C’de ve 1.100 rpm’de 10 dakika boyunca inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g’da santrifüj. Supernatan’ı çıkarın.NOT: Tripsin boncuklarının hazırlanması için bloke edici tamponun bileşimi Ek Tablo S1’de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın. 2 mL depolama tamponu ekleyin, bir vorteks karıştırıcı kullanarak karıştırın ve kullanana kadar buzdolabında saklayın.NOT: Tripsin boncukları için depolama tamponunun bileşimi Ek Tablo S1’de bulunabilir. Tamponu buzdolabında saklayın. 3. DSS / VAMS örneklemesi ve daha sonra kurutulmuş serumun ekstraksiyonu Serumu ProCTP (veya ilgilenilen protein) ile uygun seviyede yükselterek standartları hazırlayın. Ani artış hacmini toplam hacmin %1’i ≤ tutun.NOT: Burada, çivili serum standartlarının hazırlanması için suda 295 μg / mL ProCTP stok çözeltisi kullanılmıştır. Bir vorteks karıştırıcıda standartları karıştırın. DBS kartlarına 10 μL serum (çivili standartlar) uygulayın veya üreticinin yönergelerini kullanarak VAMS (10 μL) tarafından 10 μL serum toplanmasına izin verin. DSS için, noktanın noktalı daire içinde olduğundan emin olun. Ortam sıcaklığında en az 2 saat hava kurumasını bekleyin. Tüm noktayı kesin ve 2 mL düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın veya VAMS’yi tutucudan çıkarın ve 2 mL düşük proteinli bağlayıcı bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin. 100 mM amonyum bikarbonat (ABC) çözeltisinden 1.000 μL ekleyin. Kurutulmuş serumu, 1.000 rpm’de sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı kullanarak 22 ° C’de 1 saat boyunca spot / VAMS’den çıkarın. Ekstraktı triptik proteoliz için yeni bir 1.5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 4. DSS/VAMS ekstraktlarının sindirimi Numune başına 30 μL tripsin boncuk (bölüm 2’de hazırlandığı gibi) kullanın. Tüm numuneler için tripsin boncukları içeren bir hacmi yeni bir 1,5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın, 5 dakika boyunca 2.655 × g’da santrifüj yapın ve süpernatanı çıkarın. Tripsin boncuklarını, pipetlenen aynı hacimde tekrar askıya almadan önce 1 mL soğuk 50 mM ABC ile 2x yıkayın. 5 dakika boyunca 2.655 × g’da santrifüj yapın ve süpernatantı adımlar arasında çıkarın. Sindirimi başlatmak için her DSS / VAMS ekstraktına 30 μL yıkanmış tripsin boncukları ekleyin. Sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı veya benzeri bir şey kullanarak 37 ° C’de ve 1.000 rpm’de 2 saat inkübe edin. 5 dakika boyunca 2.655 × g’da santrifüj yapın ve süpernatantı (boncuk değil) yeni bir 2.0 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 100 mM ABC çözeltisine kararlı izotop etiketli (SIL) peptid ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15 N2] içeren 25 μL 14ng/mL dahili standart (IS) çözeltisi ekleyin. 5. Antikor kaplı manyetik boncuklar kullanılarak proteotipik ProGRP peptidinin yakalanması Ekstraksiyon başına 20 μL antikor kaplı boncuk (bölüm 1’de hazırlandığı gibi 20 mg / mL) kullanın. Tüm antikor kaplı boncukları yeni bir 1,5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın, mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve depolama tamponunu çıkarın. Manyetik antikor kaplı boncukları, pipetlenen aynı hacimde tekrar askıya almadan önce 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4, %0.05 polisorbat 20 ve 2 x 1 mL PBS içeren pH’lerle yıkayın. Bir vorteks karıştırıcı üzerinde karıştırın ve tampon değişimleri arasında 1 dakika boyunca mıknatısın üzerine yerleştirin.NOT: PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO4 ve 1,8 mM KH2PO4 içerir. Daha fazla stabilite için çözeltinin 10x konsantrasyonda hazırlanması önerilir. 100 mL’lik 10x PBS’nin bileşimi için bkz: Ek Tablo S1. 10x PBS 10x’in seyreltilmesi, ~ 7.4’lük bir pH elde edecektir. Sindirilmiş DSS/VAMS ekstraktı ve IS içeren her düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne 20 μL yıkanmış manyetik boncuk süspansiyonu ekleyin. Ortam sıcaklığında uçtan uca bir numune mikseri kullanarak 1 saat boyunca immünoekstraksiyon gerçekleştirin. Manyetik boncukları aşağıdaki çözeltileri kullanarak yıkayın: %0,05 (v/v) polisorbat 20 ile 500 μL PBS, 400 μL PBS, 300 μL 10 mM Tris HCl (pH 7,4) ve 300 μL 100 mM ABC.Her yıkama çözeltisinin eklenmesinden sonra, düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünü boncuklarla çıkarın ve çözeltiyi mıknatıs rafından yıkayın ve homojen olana kadar dikkatlice ters çevirin. Ardından, düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpünü mıknatısın üzerine 30 s boyunca yerleştirin, 30 s ters çevirin ve mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin. Yıkama solüsyonunu çıkarın. Bir mikrosantrifüj kullanarak kalan süspansiyonu aşağı doğru döndürün. Mıknatısın üzerine 1 dakika bekletin ve kalan yıkama solüsyonunu çıkarın. Her numuneye Tip 1 H 2 O’da 15 μL%2(v / v) formik asit ekleyin ve yakalanan peptitleri ortaya çıkarmak için sıcaklık kontrollü bir karıştırıcı veya benzeri bir şey kullanarak 22 ° C’de ve 1.000 rpm’de 5 dakika boyunca inkübe edin. Mıknatısın üzerine 1 dakika boyunca yerleştirin ve elüatı yeni bir 1.5 mL düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Bir kez tekrarlayın ve ikinci elüatı ilk elüat ile aynı düşük proteinli bağlayıcı mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Her bir elüata 20 μL 100 mM ABC ekleyin (toplam hacim 50 μL). Santrifüj (mikrosantrifüj) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) şişeleri için 40 μL elüatı mikro uçlara aktarın. 6. LC-MS / MS ile analiz Yüksek sağlamlık için elektrosprey iyonizasyonlu bir mikro LC üçlü kuadrupol MS kullanın. Mobil faz A (H 2 O ve MeCN’de 20 mM FA, 95:5 v/v) ve B (H2O ve MeCN’de 20 mM FA, 5:95 v/v) pompaları temizleyerek LC-MS/MS sistemini analiz içinhazırlayın. Analitik sütunu yerleştirin (C18, 50 mm x 1 mm iç çap [ID], 3 μm parçacıklar). Belirli bir cihaz için başlatma prosedürlerini izleyerek cihazı analiz için hazırlamaya devam edin. Cihaz yazılımında, kolonlu fırın sıcaklığını 25 °C’ye ve akış hızını 50 μL/dak’ya (0 mobil faz A) ayarlayın. Sütunu mobil faz A ile en az 15 dakika boyunca dengeleyin. Örnekleri otomatik numune alma cihazına yerleştirin. ProGRP’ye özgü, triptik peptid ALGNQQPSWDSEDSSNFK ve IS’sinin analizi için cihaz yöntemini hazırlayın.NOT: Çeşitli yöntem parametreleri cihaza özgüdür ve kullanılan belirli cihaz üzerinde optimize edilmelidir. Burada kullanılan yöntem parametrelerinin ayrıntıları 6.9 ile 6.11 arasındaki adımlarda açıklanmıştır. LC’deki gradyan programı için aşağıdaki ayarları kullanın: akış hızı: 50 μL/dak; zaman 0,0 ila 3,0 dakika arası:% 100 mobil faz A; 3,0 ila 18,0 dakika arası: %0 ila arasında doğrusal bir gradyan çalıştırın mobil faz B; zaman 18.0 ila 18.1 dakika: mobil faz B’yi% 50’den% 100’e yükseltin; zaman 18,1 ila 20,0 dakika:% 100 mobil faz B; zaman 20.0 ila 20.1 dakika: mobil faz B’yi% 100’den% 0’a düşürün; 20,1 – 30 dakika arası: Sütunu yeniden dengelemek için 0 mobil A aşaması (en az 10 sütun hacmi kullanın). MS/MS ayarları için, verimli iyonizasyon sağlayan cihaz ayarlarını kullanarak MS/MS’yi pozitif modda çalıştırın. Bu protokolü takip etmek için, +4.000 V’luk bir püskürtme voltajı, 270 °C’lik ısıtılmış bir kılcal sıcaklık, sac gaz olarak azot (5 keyfi birim) ve çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) parçalanması için argon (2 mTorr) kullanın. Cihaz izin veriyorsa, LC akışını MS yerine koşunun ilk 2 dakikasını (0-2 dakika) ve son 1 dakikasını (29-30 dakika) boşa harcamak için yönlendirin. (A) imza peptidi (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1.005.45→913.3, 1.005.45→1.028.3 ve 1.005.45→1.398.5 ve (B) IS SIL peptidi (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1.009.45→921.3, 1.009.45→1.036.3 ve 1.009.45→1.406.5 için seçilen reaksiyon izleme (SRM) geçişlerini kullanın. İzlenen tüm geçişler için optimize edilmiş çarpışma enerjisi (bu protokolde 35 V) kullanın. LC-MS/MS sisteminiz için mevcut yazılımı kullanarak çalıştırılacak örnekleri içeren bir dizi hazırlayın. Enjeksiyon hacmini 10 μL’ye ayarlayın.NOT: Gerektiğinde boş numuneler ve kalite kontrol numuneleri eklediğinizden emin olun. Diziyi başlatmak için enstrüman yazılımında “Run sequence” (Sırayı çalıştır) düğmesine basın. Afinite yakalanan, ProGRP’ye özgü, triptik peptid ALGNQQPSWDSEDSSNFK ve IS SIL peptidinin tepe alanını izleyin.NOT: İmza peptidi ALGNQQPSWDSEDSSNFK’nın seçimi ve onaylanması14’ün başka bir yerinde açıklanmıştır.