أخذ العينات المجهرية في تحليل البروتين القائم على قياس الطيف الكتلي المستهدف للبروتينات منخفضة الوفرة
Summary
يتم تقديم بروتوكول لتحديد المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة من عينات المصل المجففة المتمثلة في الببتيد المطلق للبروغاسترين (ProGRP). تستخدم الخرزات المغناطيسية المغلفة بالأجسام المضادة للتنظيف الانتقائي وإثراء ببتيد ProGRP البروتيني. يتم تحليل الببتيد الذي تم التقاطه لاحقا بواسطة مطياف الكتلة اللوني الترادفي السائل.
Abstract
تقدم هذه الورقة بروتوكولا يحتوي على أوصاف مفصلة لتنظيف العينات بكفاءة من البروتينات منخفضة الوفرة من العينات المجففة. يتم إجراء ذلك باستخدام التحلل البروتيني القائم على الخرز قبل تحديد تقارب الببتيد البروتيني وقياس الطيف الكتلي الترادفي للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS / MS). يمكن تطبيق الإجراء على كل من العينات المجففة التقليدية باستخدام البطاقات الورقية (على سبيل المثال ، بقع الدم المجففة [DBSs] وبقع المصل المجففة [DSSs]) ، وكذلك العينات التي تم جمعها باستخدام طرق أخذ العينات الأحدث مثل أخذ العينات المجهرية الامتصاصية الحجمية (VAMS). بالإضافة إلى وصف هذا الإجراء ، يتم تقديم إعداد كل من حبات التربسين والخرز المغلفة بالأجسام المضادة بطريقة خطوة بخطوة في هذا العمل. مزايا الإجراء المقدم هي تحلل البروتين الفعال من حيث الوقت باستخدام الخرز والتنظيف القوي الانتقائي باستخدام التقاط تقارب الببتيد. يصف الإجراء الحالي تحديد العلامة الحيوية لسرطان الرئة ذو الخلايا الصغيرة (SCLC) منخفض الوفرة ، الببتيد المطلق للبروجاسترين (ProGRP) ، في المصل المجفف (كل من DSSs و VAMS). تسهل الإجراءات التفصيلية لإعداد الخرزة تنفيذ سير العمل في التطبيقات الجديدة أو المختبرات الأخرى. وتبين أن النتائج قد تعتمد على مواد أخذ العينات؛ وبالنسبة للمشروع الحالي، شوهدت كثافة إشارة أعلى للعينات المجمعة باستخدام نظام VAMS مقارنة بأنظمة الترصد الديموغرافي.
Introduction
أخذ العينات المجهرية موجود منذ أكثر من 100 عام منذ أن وصف Ivar Bang مراقبة الجلوكوز من DBSs في عام 19131. بعد أن قدم Guthrie و Susi DBSs في عام 1963 لتحديد الفينيل ألانين في الأطفال حديثي الولادة2 ، أصبحت هذه التقنية منتشرة بشكل متزايد. تم تقديم التقارير الأولى من DBSs لأخذ العينات وتخزين البروتينات في أوائل سبعينيات القرن العشرين3،4 ، وبعد عقد من الزمان ، في ثمانينيات القرن العشرين ، وجدنا أول تقرير لقياس الطيف الكتلي (MS) لتحديد البروتينات من DBSs5. على الرغم من هذا الإدخال المبكر ، لم يكن تحديد مرض التصلب العصبي المتعدد للبروتينات من DBSs وتقنيات أخذ العينات المجهرية الأخرى أكثر انتشارا إلا بعد مطلع القرن.
في السياق السريري ، من المهم تحديد البروتينات في تشخيص ومتابعة الأمراض ، وكذلك لأغراض مراقبة العلاج والمنشطات. لا يزال هذا التحديد المستهدف لتحليلات البروتين بواسطة MS من كميات صغيرة من العينات المجففة يمثل تحديا ، وغالبا ما يتطلب إعدادا مكثفا للعينة قبل التحليل.
عادة ما يتم إجراء التحديد الكمي المستهدف للبروتينات بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد من خلال تطبيق النهج التصاعدي ، وهضم البروتينات إلى الببتيدات قبل التحليل. ينتج عن هذا الإجراء عدد لا يحصى من الببتيدات ، مما يجعل التحليل المباشر للعينة البيولوجية المهضومة أمرا صعبا. تتمثل إحدى طرق التحايل على ذلك في تطبيق خطوة تنظيف التقارب الانتقائي مقدما لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد إما قبل أو بعد الهضم6،7،8. وبهذه الطريقة ، يتم عزل البروتين محل الاهتمام (أو الببتيد البروتيني ، إذا تم تنفيذ خطوة التقاط التقارب بعد الهضم) بشكل انتقائي من مصفوفة العينة قبل التحليل ، مما يوفر حدود اكتشاف أقل9.
يتميز أخذ العينات المجهرية باستخدام بطاقات DBS بمزايا معينة مقارنة بعينات الدم التقليدية ، بما في ذلك انخفاض حجم العينة ، وأخذ العينات الأقل توغلا ، وزيادة استقرار التخزين. ومع ذلك ، فإن مصفوفة العينة مختلفة ويمكن أن تقدم تحديات أخرى في التحليل (على سبيل المثال ، مصفوفة العينة المجففة مقابل السائلة والدم الشعري مقابل المصل أو البلازما)10,11. التحدي الآخر الذي لوحظ مع DBSs هو ما يسمى تأثير الهيماتوكريت ، حيث يؤثر الهيماتوكريت في الدم على حجم العينة الذي تمت معالجته بشكل أكبر للتحليل ، وبالتالي يقدم التباين بين الأفراد في التحليل12. تعالج وحدات أخذ العينات المجهرية الأحدث ، مثل VAMS التي تم تقديمها في 201413 ، هذه المشكلة من خلال جمع كمية ثابتة من الدم بدلا من قطرة الدم.
يصف هذا البروتوكول إعدادا لتحليل المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة من العينات الدقيقة المجففة. بعد الشطف ، يتم هضم العينة المجففة ، وبعد ذلك ، يتم عزل الببتيد البروتيني عن طريق التقاط تقارب الببتيد. تحليل النموذج هو العلامة الحيوية SCLC ProGRP. نظرا لأنه لا يمكن تحديد ProGRP بشكل موثوق من الدم الكامل ، فقد تم استخدام المصل كمصفوفة عينة. يتم عرض النتائج التمثيلية من كل من DSSs وعينات المصل التي تم جمعها باستخدام VAMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
يحتوي البروتوكول الموصوف على معلومات حول كيفية إجراء العديد من الخطوات المهمة في تحليل المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة من العينات الدقيقة المجففة (DSS و VAMS) ، بما في ذلك تحضير حبات التربسين والخرز المغناطيسي المغلف بالأجسام المضادة. بناء على الخبرة السابقة ، نتعامل دائما مع الجسم المضاد بالحمض قبل تجميد حبة الخرز لتحسين اتجاه الأجسام المضادة15.
تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة في هذا الإجراء في اختيار تنسيق أخذ العينات المجهرية الأنسب. أولا ، يجب على المرء أن يفكر فيما إذا كان يمكن تحديد المادة المراد تحليلها من الدم الكامل ، أو إذا كان التركيز يتأثر بخلايا الدم ويجب تحديده في المصل أو البلازما (كما هو الحال بالنسبة للنموذج المراد تحليله ، ProGRP).
لكل من النهج القائمة على الورق والبوليمر مزايا وقيود. بالنسبة لبرنامج ProGRP ، يوفر VAMS ميزة واضحة فيما يتعلق باستعادة التحليل بعد الاستخراج من جهاز أخذ العينات. ومع ذلك ، يمكن تحسين ذلك باستخدام حل استخراج مختلف لعينات DSS. ومع ذلك، من المهم أخذ هذا التفاعل المحتمل بين المادة المراد تحليلها وأخذ العينات في الاعتبار؛ لأنه قد يؤدي إلى زيادة التباين التحليلي وارتفاع حدود الكشف. نظرا لأن IS المستخدم هو ببتيد SIL ويضاف لأول مرة بعد الهضم ، فإن IS يصحح الخطوات التالية للهضم (على سبيل المثال ، استخراج التقارب وتحليل LC-MS / MS). تصحيح IS غير ممكن للاستخراج من DSS / VAMS وخطوة الهضم.
يتم استخدام نوعين من الخرز في الإجراء: حبات التربسين للهضم بعد استخراج عينة المصل من جهاز أخذ العينات ، والخرز المغناطيسي المغلف بالأجسام المضادة لالتقاط الببتيد البروتيني بعد الهضم. أحد الأسباب الرئيسية لاستخدام حبات التربسين ، بالإضافة إلى تسريع عملية الهضم ، هو تقليل نشاط التربسين المتبقي في العينة أثناء التقاط التقارب. هذا مهم لتجنب التحلل البروتيني التربتي ل mAb أثناء التقاط التقارب.
تم استخدام حبات الأغاروز لتحضير حبات التربسين ، بينما تم استخدام الخرز المغناطيسي لإعداد الخرزات المغلفة بالأجسام المضادة. حبات الأغاروز أقل تكلفة من الخرز المغناطيسي ولكن لها قيود على أن فصل الخرز عن المحلول يتطلب الطرد المركزي. هذا يجعل فصل الخرز والمادة الطافية أقل كفاءة من استخدام الخرز المغناطيسي. بالإضافة إلى ذلك ، من الصعب أتمتة سير العمل باستخدام حبات الأغاروز. ومع ذلك ، تتوفر حبات مغناطيسية يتم تنشيطها بواسطة NHS ويمكن استخدامها لسير عمل إعداد العينات بشكل أكثر بساطة وآلية.
أخذ العينات المجهرية هو اتجاه مهم في التحليل الحيوي لكل من الأدوية والمؤشرات الحيوية. يتمثل أحد التحديات في النهج الحالي في الكمية المحدودة من حجم العينة (10 ميكرولتر) ، والتي قد تكون ذات أهمية خاصة في تحديد التحليلات منخفضة الوفرة للغاية مثل ProGRP (مستوى pg / mL-low ng / mL). ومع ذلك ، يمكن التحايل على هذا التحدي باستخدام أحدث المعدات التحليلية. بالنسبة لهذه التحليلات منخفضة الوفرة ، يعد اختيار تحضير العينة أمرا بالغ الأهمية ، وغالبا ما تكون هناك حاجة إلى تنظيف انتقائي للعينة من خلال التقاط التقارب القائم على الأجسام المضادة. وبما أنه ثبت أن التقاط الببتيد يوفر مستخلصات أنظف وحدود كشف أقل من التقاط البروتين (باستخدام نفس الجسم المضاد)14، فإن الطريقة الحالية تركز على هذا النهج بالاقتران مع أخذ العينات المجهرية. ميزة أخرى لنهج التقاط الببتيد هي أن الببتيد IS SIL يصحح أيضا خطوة التقاط التقارب.
في هذا العمل ، تم استخدام جسم مضاد يستهدف البروتين لالتقاط الببتيد. هذه ميزة لأن توافر الأجسام المضادة الجاهزة التي تستهدف البروتينات أعلى من الأجسام المضادة الجاهزة التي تستهدف الببتيدات البروتينية. ومع ذلك ، لكي يلتقط الجسم المضاد للبروتين الببتيد البروتيني بكفاءة ، يجب أن يكون الحاتم سليما بعد هضم البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة للعديد من الأجسام المضادة ، فإن الخاتمة الدقيقة غير معروفة ، مما يجعل البحث عن جسم مضاد مضاد للبروتين مملا. هذا يحد من عدد الأجسام المضادة المضادة للبروتين المتاحة المطبقة على التقاط الببتيد. تم توضيح الإجراء الموصوف باستخدام المصل كمصفوفة و ProGRP كتحليل الهدف. الغرض من الإجراء هو أن يكون قابلا للتطبيق على المصفوفات الأخرى والتحليلات المستهدفة الأخرى. بدلا من استخدام جسم مضاد مضاد للبروتين متاح تجاريا لالتقاط تقارب الببتيد البروتيني ، من الممكن أيضا استخدام الأجسام المضادة المضادة للببتيد المصنوعة خصيصا. يوضح الشكل 5 كفاءة تنظيف التقاط الببتيد مقارنة بالتقاط البروتين. من خلال تبادل حبات الأغاروز المستخدمة لإعداد حبات التربسين مع الخرز المغناطيسي ، يجب أن يكون الإجراء متوافقا أيضا مع محطات عمل تحضير العينات الروبوتية في السوق.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نقدر كثيرا البروفيسور إليزابيث باوس في مستشفى الراديوم النرويجي (مستشفى جامعة أوسلو ، أوسلو ، النرويج) لتوفير معيار ProGRP والجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ProGRP ، M18. تمت تغطية رسوم النشر بمنحة من Apoteker Harald Conrad Thaulows legat. Trine Grønhaug Halvorsen و Léon Reubsaet شريكان في اتحاد الشبكة الوطنية للبنية التحتية للبروتينات المتقدمة (NAPI) ، الذي يموله برنامج INFRASTRUKTUR التابع لمجلس البحوث النرويجي (رقم المشروع: 295910).
Materials
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
References
- Bang, I. B. Fresenius. Zeitschrift für analytische Chemie. 52 (7), 521-523 (1913).
- Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
- Laurell, C. B. A screening test for α1-antitrypsin deficiency. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).
- Thielmann, K., Aquino, A. M. Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure. Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).
- Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn). Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).
- Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers. Analytica Chimica Acta. 1182, 338714 (2021).
- Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, 132-139 (2017).
- Neubert, H., et al. Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).
- Pan, S., et al. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications. Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).
- Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).
- Londhe, V., Rajadhyaksha, M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102 (2020).
- Denniff, P., Spooner, N. The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).
- Denniff, P., Spooner, N. Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).
- Levernæs, M. C. S., et al. Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies. RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).
- Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase. Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).
