Микровыборка в целевом масс-спектрометрическом анализе белков с низким содержанием белка
Summary
Представлен протокол определения биомаркеров низкого содержания из высушенных образцов сыворотки на примере биомаркера пептида высвобождения прогастрина (ProGRP). Магнитные шарики, покрытые антителами, используются для селективной очистки и обогащения протеотипического пептида ProGRP. Захваченный пептид впоследствии анализируется с помощью жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии.
Abstract
В этой статье представлен протокол с подробным описанием эффективной очистки образцов от белков с низким содержанием из высушенных образцов. Это выполняется с использованием протеолиза на основе гранул перед определением аффинного захвата протеотипического пептида и тандемной масс-спектрометрии жидкостной хроматографии (ЖХ-МС/МС). Процедура может быть применена как к обычным высушенным образцам с использованием бумажных карт (например, высушенные пятна крови [DBS] и высушенные сывороточные пятна [DSS]), так и к образцам, собранным с помощью новых методов отбора проб, таких как объемный абсорбционный микроотбор проб (VAMS). В дополнение к описанию этой процедуры, в этой работе поэтапно представлено получение как трипсиновых шариков, так и шариков, покрытых антителами. Преимуществами представленной процедуры являются эффективный по времени протеолиз с использованием гранул и селективная надежная очистка с помощью пептидного аффинного захвата. Текущая процедура описывает определение биомаркера малораспространенного мелкоклеточного рака легкого (МРЛ), пептида, высвобождающего прогастрин (ProGRP), в высушенной сыворотке (как DSS, так и VAMS). Подробные процедуры подготовки шариков облегчают внедрение рабочего процесса в новых приложениях или других лабораториях. Показано, что результаты могут зависеть от материала для отбора проб; в рамках настоящего проекта для образцов, собранных с помощью VAMS, наблюдалась более высокая интенсивность сигнала по сравнению с DSS.
Introduction
Микровыборка существует уже более 100 лет с тех пор, как Ивар Банг описал мониторинг глюкозы с помощью DBS в 1913 году1. После того, как в 1963 году Гатри и Сьюзи представили DBS для определения фенилаланина у новорожденных2, этот метод становится все более распространенным. Первые сообщения о DBS для отбора проб и хранения белков были сделаны в начале 1970-х годов3,4, а десятилетие спустя, в 1980-х годах, мы нашли первый отчет о масс-спектрометрии (MS) для определения белков из DBS5. Несмотря на это раннее введение, только на рубеже веков определение белков РС из DBS и других методов микровыборки стало более распространенным.
В клиническом контексте представляет интерес определение белков в диагностике и последующем наблюдении за заболеваниями, а также для мониторинга лечения и допинговых целей. Это целенаправленное определение белковых аналитов с помощью РС из небольших количеств высушенных образцов по-прежнему является сложной задачей и часто требует обширной подготовки образцов перед анализом.
Целенаправленное количественное определение белков с помощью РС обычно выполняется с применением подхода «снизу вверх», расщепляя белки до пептидов перед анализом. Эта процедура производит множество пептидов, что затрудняет прямой анализ переваренного биологического образца. Способ обойти это заключается в применении этапа селективной очистки сродства перед анализом РС до или после разложения 6,7,8. Таким образом, интересующий белок (или его протеотипический пептид, если стадия аффинного захвата выполняется после расщепления) селективно выделяют из матрицы образца перед анализом, обеспечивая более низкие пределы обнаружения9.
Микроотбор проб с использованием карт DBS имеет определенные преимущества по сравнению с обычными образцами крови, включая небольшой объем образца, менее инвазивный отбор проб и повышенную стабильность при хранении. Однако матрица образца отличается и может создавать другие проблемы при анализе (например, матрица высушенных и жидких образцов и капиллярная кровь по сравнению с сывороткой или плазмой)10,11. Еще одной проблемой, которая наблюдается при использовании DBS, является так называемый гематокритный эффект, при котором гематокрит крови влияет на объем образца, дополнительно обрабатываемого для анализа, и, следовательно, вносит межиндивидуальную вариабельность в анализ12. Новые микропробоотборники, такие как VAMS, представленные в 2014 году13, решают эту проблему, собирая фиксированный объем крови вместо капли крови.
Этот протокол описывает установку для анализа биомаркеров низкого содержания из высушенных микрообразцов. После элюирования высушенный образец расщепляют и, впоследствии, выделяют протеотипический пептид путем пептидного аффинного захвата. Модельным аналитом является биомаркер МРЛ ProGRP. Поскольку ProGRP не может быть надежно определен из цельной крови, в качестве матрицы образца использовали сыворотку. Показаны репрезентативные результаты как DSS, так и образцов сыворотки, собранных с использованием VAMS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Описанный протокол содержит информацию о том, как провести несколько важных этапов анализа биомаркеров низкого содержания из высушенных микрообразцов (DSS и VAMS), включая получение трипсиновых шариков и магнитных шариков, покрытых антителами. Основываясь на предыдущем опыте, мы всегда обрабатываем антитела кислотой перед иммобилизацией шариков, чтобы улучшить ориентацию антител15.
Одним из важнейших шагов в этой процедуре является выбор наиболее подходящего формата микродискретизации. Во-первых, необходимо учитывать, может ли рассматриваемый аналит быть определен из цельной крови, или концентрация зависит от клеток крови и должна быть определена в сыворотке или плазме (как для модельного аналита, ProGRP).
Подходы, основанные как на бумаге, так и на полимерах, имеют свои преимущества и ограничения; для ProGRP VAMS дает явное преимущество в отношении извлечения аналита после извлечения из пробоотборника. Однако это, вероятно, может быть оптимизировано с использованием другого решения для экстракции образцов DSS. Тем не менее, это потенциальное взаимодействие между анализируемым веществом и материалом для отбора проб важно учитывать, поскольку оно может привести к увеличению аналитических вариаций и более высоким пределам обнаружения. Поскольку используемая ИС представляет собой пептид SIL и впервые добавляется после разложения, IS корректирует этапы после разложения (например, аффинную экстракцию и анализ ЖХ-МС/МС). Коррекция ИС невозможна при экстракции из DSS/VAMS и стадии сбраживания.
В процедуре используются два типа шариков: гранулы трипсина для расщепления после извлечения образца сыворотки из пробоотборника и магнитные шарики, покрытые антителами, для захвата протеотипического пептида после сбраживания. Основной причиной использования трипсиновых шариков, помимо ускорения пищеварения, является минимизация остаточной активности трипсина в образце во время аффинного захвата. Это важно, чтобы избежать триптического протеолиза mAb во время аффинного захвата.
Агарозные шарики использовались для приготовления трипсиновых шариков, в то время как магнитные шарики использовались для получения шариков, покрытых антителами. Агарозные шарики дешевле, чем магнитные шарики, но имеют ограничение, заключающееся в том, что отделение шариков от раствора требует центрифугирования. Это делает разделение шариков и надосадочной жидкости менее эффективным, чем при использовании магнитных шариков. Кроме того, автоматизация рабочего процесса затруднена с помощью агарозных шариков. Тем не менее, магнитные шарики, активируемые NHS, доступны и могут использоваться для более упорядоченного и автоматизированного рабочего процесса подготовки образцов.
Микровыборка является важным направлением в биоанализе как лекарств, так и биомаркеров. Одной из проблем, связанных с нынешним подходом, является ограниченный объем пробы (10 мкл), который может иметь особое значение при определении аналитов с очень низким содержанием, таких как ProGRP (пг/мл – низкий уровень нг/мл). Однако эту проблему можно обойти с помощью современного аналитического оборудования. Для этих аналитов с низким содержанием содержится решающее значение выбор пробоподготовки, и чаще всего требуется селективная очистка образца путем захвата аффинности на основе антител. Поскольку было показано, что захват пептидов обеспечивает более чистые экстракты и более низкие пределы обнаружения, чем захват белка (с использованием того же антитела)14, настоящий метод фокусируется на этом подходе в сочетании с микроотбором проб. Еще одно преимущество подхода к захвату пептидов заключается в том, что пептид IS SIL также корректирует стадию аффинного захвата.
В этой работе антитело, нацеленное на белок, использовалось для захвата пептидов. Это является преимуществом, поскольку доступность готовых антител, нацеленных на белки, выше, чем готовых антител, нацеленных на протеотипические пептиды. Однако для того, чтобы антибелковое антитело эффективно захватывало протеотипический пептид, эпитоп должен быть неповрежденным после переваривания белка. Кроме того, для многих антител точный эпитоп неизвестен, что делает поиск антибелкового антитела утомительным. Это ограничивает количество доступных антибелковых антител, применимых для захвата пептидов. Описанная процедура продемонстрирована с использованием сыворотки в качестве матрицы и ProGRP в качестве целевого аналита. Предполагается, что процедура будет применима к другим матрицам и другим целевым аналитам. Вместо того, чтобы использовать коммерчески доступное антибелковое антитело для аффинного захвата протеотипического пептида, можно также использовать изготовленные на заказ антипептидные антитела. Эффективность очистки захвата пептидов по сравнению с захватом белка проиллюстрирована на рисунке 5. Заменяя агарозные шарики, используемые для приготовления трипсиновых шариков, магнитными шариками, процедура также должна быть совместима с роботизированными рабочими станциями пробоподготовки, представленными на рынке.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы выражаем глубокую признательность профессору Элизабет Паус из Норвежской радиевой больницы (Университетская больница Осло, Осло, Норвегия) за предоставление стандарта ProGRP и моноклонального антитела против ProGRP, M18. Гонорар за публикацию был покрыт за счет гранта адвоката Харальда Конрада Таулова. Трине Грёнхауг Халворсен и Леон Рубсает являются партнерами в консорциуме Национальной сети передовой протеомной инфраструктуры (NAPI), который финансируется Исследовательским советом Норвегии по программе INFRASTRUKTUR (номер проекта: 295910).
Materials
| Acetic acid N-hydroxysuccinimide ester | Carbosynt (Staad, Switzerland) | FA33719 | Store in freezer below -20 °C |
| ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%) |
Innovagen (Lund, Sweden) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Ammonium bicarbonate BioUltra (≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 09830-500G | |
| Aquasil C18 column, 3 µm, 50 mm x 1 mm | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | 77503-051030 | Analytical column compatible with 100% aqueous mobile phase |
| Benzamidine (≥ 95.0% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 12072 | Store in fridge at 2-6 °C |
| Calsium chloride dihydrate (≥ 99% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 223506-500G | |
| Centrifuge 5804 | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 5804000010 | |
| Cloned ProGRP isoform 1 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Disodium hydrogenphosphate dihydrate (pro analysis) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 30435-500G | |
| Disodium hydrogenphosphate dodecahydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06579.0500 | |
| Dynabeads M-280 tosylactivated 10 mL | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 14204 | Store in fridge at 2-6 °C |
| DynaMag-2 | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 123-21D | |
| Ethanolamine (pro analysis, ≥ 99%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | #02400 | |
| Formic acid (≥ 99% ) for LC-MS | VWR International (Radnor, PA, USA) | 84865.260 | |
| FTA DMPK-C cellulose card | Whatman (Kent, UK) | WB129243 | DBS card |
| HPLC vials, clear glass, 1.5 mL, 32 x 11.6 mm, Clean Pack | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 11 09 0519 | |
| Hulamixer sample mixer | Invitrogen (Carlsbad, USA) | 101561503016 | Sample mixer with end-over-end mixing and reciprocal rotation and vibration |
| Human serum from healty blood donors | Bloodbank, Ullevål, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in freezer below -20 °C |
| Hydrochloric acid fuming 37% (Emsure for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00317.1000 | |
| LC-MS/MS system: Ultimate 3000 system (Autosampler, WPS-3000TRS; Micropump, LPG-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) and TSQ Quantum access. Controlled by Xcalibur 2.2 SP1.48 | Thermo scientific (Waltham, MA, USA) | Not applicable | |
| LiChrosolv Acetonitrile hypergrade for LC-MS | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.00029.2500 | |
| LL Biotrode, Combined glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0224.100 | |
| Magnetic stirrer, Type M10 | Franz Morat KG (Eisenbach, Germany) | 10236 | |
| Micro inserts, glass (31 x 6 mm, 0.1 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 548-0006 | |
| MilliQ integral 3 with Q-POD | Merck Millipore (Molsheim, France) | ZRXQ003T0 | For production of Type 1 water |
| monoclonal antibody M18 | Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norway) | Not applicable | Store in fridge at 2-6 °C |
| Neoteryx Mitra microsampler (10 μL) 4 sampler Clamshell | Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | NC1382947 | |
| NHS-activated sepharose beads 4 fast flow | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | GE17-0906-01 | Agarose beads, store in fridge at 2-6 °C |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 613-2911 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 10 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790012 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 1,000 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 791002 | |
| Optifit, Refill pipet tips, 200 μL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 790202 | |
| pH glass electrode | Metrohm (Herisau, Sveits) | 6.0233.100 | |
| pH meter 744 | Metrohm (Herisau, Sveits) | 8.744.1003 | |
| Pipet 10 mL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725090 | |
| Pipet m10 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725020 | |
| Pipet m100 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725050 | |
| Pipet m1,000 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725070 | |
| Pipet m20 µL | Sartorius Biohit (Helsinki, Finland) | 725030 | |
| Potassium chloride (KCl ≥ 99.9%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P-3911 | |
| Potassium dihydrogenphosphate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.04873.0250 | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 0.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0133 (0030 108.094) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0132 (0030 108.116) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 2.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0134 (0030 108.450) | |
| Protein LoBind Eppendorf tube 5.0 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 525-0792 (0030108.302) | |
| Scissors | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | Z186716-1EA | |
| Sodium azide (BioUltra; ≥ 99.5% ) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | 71289-5G | |
| Sodium chloride (for analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06404.1000 | |
| Sodium dihydrogenphosphate monohydrate (pro analysis) | Merck (Darmstadt, Tyskland) | 1.06346.0500 | |
| Sodium hydroxide (AnalaR NORMAPUR) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 28244.295 | |
| Sodium tetraborate decahydrate (≥ 99. %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | S9640-500G | |
| Spectrafuge Mini Centrifuge | LABNET International (Edison, NJ, USA) | C1301 | |
| Stirring magnet, 25 mm x 6 mm Ø, circular | Leybold (Cologne, Germany) | 666 851 | |
| Stuart Scientific SA8 vortex mixer | Stuart (Staffordshire, UK) | Z648531-1EA | |
| SuperClear centrifuge tubes (15 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0150 | |
| SuperClear centrifuge tubes (50 mL) | VWR International (Radnor, PA, USA) | 525-0155 | |
| Thermomixer comfort 1.5 mL | Eppendorf (Hamburg, Tyskland) | 53,55,27,831 | Temperature controlled mixer |
| Trizma base (reagent grade, ≥ 99.0 %) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T6066 | Tris(hydroxymethyl)aminometan (tris) |
| Trizma HCl (reagent grade, ≥ 99.0%) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T3253-100G | Tris(hydroxymethyl)aminometan HCl (tris HCl) |
| Trypsin (TCPK-treated from bovine pancreas, 10,000-15,000 BAEE units/mg Protein) | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | T8802 | Store in freezer below -20 °C |
| Tween 20 | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | P7949-500ML | polysorbate 20 |
| Tweezers | Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) | TEM-78511-27 | |
| Vial caps, white, 9 mm | Nerliens Meszansky (Oslo, Norge) | LPP 09 15 0981 | |
| Mitra microsampler with VAMS (Volumetric adsorptive microsampling) technology, 10 µL, 4-sampler clamshell | Neoteryx (Torrance, CA, USA) |
References
- Bang, I. B. Fresenius. Zeitschrift für analytische Chemie. 52 (7), 521-523 (1913).
- Guthrie, R., Susi, A. A simple phenylalanine method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics. 32 (3), 338-343 (1963).
- Laurell, C. B. A screening test for α1-antitrypsin deficiency. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. 29 (3), 247-248 (1972).
- Thielmann, K., Aquino, A. M. Whole blood samples dried and stored on filter paper as substrate for the electrophoretic separation on hemoglobin S from hemoglobin A. A screening procedure. Clinica Chimica Acta. 35 (1), 237-238 (1971).
- Wada, Y., Fujita, T., Kidoguchi, K., Hayashi, A. Fetal hemoglobin variants in 80,000 Japanese neonates: High prevalence of Hb F Yamaguchi (AγT 80 Asp→Asn). Human Genetics. 72 (3), 196-202 (1986).
- Halvorsen, T. G., McKitterick, N., Kish, M., Reubsaet, L. Affinity capture in bottom-up protein analysis-overview of current status of proteolytic peptide capture using antibodies and molecularly imprinted polymers. Analytica Chimica Acta. 1182, 338714 (2021).
- Halvorsen, T. G., Reubsaet, L. Antibody based affinity capture LC-MS/MS in quantitative determination of proteins in biological matrices. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 95, 132-139 (2017).
- Neubert, H., et al. Protein biomarker quantification by immunoaffinity liquid chromatography-tandem mass spectrometry: Current state and future vision. Clinical Chemistry. 66 (2), 282-301 (2020).
- Pan, S., et al. Mass spectrometry based targeted protein quantification: methods and applications. Journal of Proteome Research. 8 (2), 787-797 (2008).
- Enderle, Y., Foerster, K., Burhenne, J. Clinical feasibility of dried blood spots: Analytics, validation, and applications. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 130, 231-243 (2016).
- Londhe, V., Rajadhyaksha, M. Opportunities and obstacles for microsampling techniques in bioanalysis: Special focus on DBS and VAMS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 182, 113102 (2020).
- Denniff, P., Spooner, N. The effect of hematocrit on assay bias when using dbs samples for the quantitative bioanalysis of drugs. Bioanalysis. 2 (8), 1385-1395 (2010).
- Denniff, P., Spooner, N. Volumetric absorptive microsampling: A dried sample collection technique for quantitative bioanalysis. Analytical Chemistry. 86 (16), 8489-8495 (2014).
- Levernæs, M. C. S., et al. Immunocapture sample clean-up in determination of low abundant protein biomarkers-a feasibility study of peptide capture by anti-protein antibodies. RSC Advances. 9 (60), 34902-34911 (2019).
- Conradie, J. D., Govender, M., Visser, L. Elisa solid phase: Partial denaturation of coating antibody yields a more efficient solid phase. Journal of Immunological Methods. 59 (3), 289-299 (1983).
