低存在量タンパク質の標的質量分析ベースのタンパク質分析におけるマイクロサンプリング(英語)

健康な献血者からの血清を標準溶液の調製に使用した。健康な献血者からの血清の使用は、ノルウェーの法律に厳密に従って行われた。インフォームドコンセントはすべての被験者から得られた。血清サンプルは、関連するガイドラインおよび規制に従った方法を使用して分析されました。記載されたプロトコルは、前の作業14で記述された方法の修正版である。バッファーと溶液の組成の概要とそれらの調製方法は 補足表S1に記載されていますが、材料表にはこのプロトコルで使用される 材料 、機器、および試薬が含まれています。 1. 抗体コート磁気ビーズの作製 所望の数のビーズを調製するのに必要な抗体の量を計算する。磁気ビーズ50 mgあたり1 mgの抗体を使用してください。注:通常、後続の実験では、サンプルあたり20 μLの20 mg/mLビーズ懸濁液が使用されます(ステップ5.1を参照)。 所望の数のビーズを調製するために必要な抗体量を計算する。注:抗体量は抗体濃度に依存し、抗体ごとに計算する必要があります。 希望する量の抗体溶液を5 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。例として、抗体溶液に1 mg/mLの抗体が含まれている場合、0.4 mLを使用して1.0 mLのビーズ懸濁液を調製します(1 mgの抗体/50 mgビーズを含む20 mgビーズ/mL)。注:抗体はアミンフリーのバッファーに入っている必要があります。吸着による分析物の損失を避けるために、タンパク質を含むすべての溶液に低タンパク質結合マイクロ遠心チューブを使用してください。 抗体溶液に小さな磁気攪拌棒を加え、連続攪拌下でpHを2.5に調整します。微小電極を備えたpHメーターを使用してpHを測定し、1.0 M HClの規定容量を段階的に添加してpHを調整します(1.0 M HClを10 μLずつ添加することから始め、pHが2.5に近づくにつれて容量を減らします)。pHを2.5に調整するために必要な1.0 M HClの総量を記録します。 マイクロ電極を取り外し、酸性化抗体をマグネチックスターラー上で氷上で1時間インキュベートします。注:抗体の酸処理は、ビーズ上の抗体の正しい配向を促進するために行われます。HClの濃度は、抗体溶液中の緩衝液濃度に応じて、0.5 Mまたは0.2 M HClに低下させることができます。 抗体溶液を中和します。微小電極を備えたpHメーターを使用してpHを測定し、規定容量の1.0 M NaOHを段階的に添加してpHを7に調整します(10 μLの部分から始めて、pHが7に近づくにつれて容量を減らします)。添加した1.0 M NaOHの総体積を記録します。注:NaOHの濃度は、ステップ1.4で使用したHCl濃度と同じである必要があります。NaOHは非常に腐食性があります。手袋や適切な目の保護具などの保護具を使用してください。 使用するトシル活性化磁気ビーズの希望体積を計算します。注:通常、小規模カップリングを行う場合は、20 mgビーズ/ mLを使用することをお勧めします。最低5mgのビーズを使用する必要があります。 磁気ビーズ懸濁液をボルテックスミキサーで完全に混合し、所望の量のビーズ懸濁液を含む容量を引き出します。例として、1 mLのビーズ懸濁液を調製するには、20 mgのビーズを含む容量を取り出します(ビーズの濃度が30 mg/mLの場合は667 μL)。 ビーズ懸濁液を磁気ラックに1分間置き、上清を取り除きます。等量のタイプ1 H 2 O(30 mg/mLビーズ溶液を使用して20 mg/mL抗体コーティングビーズ1 mLを調製した場合は667 μL)でビーズを2倍洗浄します。洗浄液を加えるたびにボルテックスミキサーを使用して混合し、上清を除去する前に磁気ラックに1分間置きます。 酸処理抗体、0.5 Mホウ酸緩衝液(pH 9.5)(最終濃度は0.1 Mであるため総容量の1/5、ビーズ懸濁液1 mLを調製するには0.2 mLに相当)、および抗体カップリング用カップリングバッファー(抗体コーティング磁気ビーズ1 mLを調製するには、カップリングバッファーの容量を1 mL – 酸処理抗体の容量 – 0.2 mLのホウ酸塩バッファー)と等しくする必要があります。ボルテックスミキサーを使用して混合します。注:酸処理された抗体の容量は、抗体溶液の容量(1 mg/mLの抗体溶液を使用して1 mLのビーズ懸濁液を調製する場合は0.4 mL)+pHを2.5に調整するために使用した1.0 M HClの容量+pHを7に調整するために使用した1.0 M NaOHの容量に等しくなります。注:抗体カップリング用の0.5 Mホウ酸緩衝液(pH 9.5)およびカップリング緩衝液の組成は、 補足表S1に記載されています。 エンドオーバーエンドのサンプルミキサーを使用して、できれば往復回転と振動で周囲温度で一晩回転させます。 239 × gで10分間遠心分離します。チューブを磁石の上に2分間置き、上清を取り除きます。 エンドオーバーエンドサンプルミキサーを使用して、周囲温度で抗体ビーズの保存バッファー中で回転させることにより、ビーズを2 x 2時間、一晩1回洗浄します。手順 1.10 の合計ボリュームと同じボリュームを使用します。チューブを磁石に1分間置き、各洗浄の間に上清を取り除きます。注:抗体ビーズの保存バッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。 所望のストック濃度のビーズ(典型的には20mg/mL)を用いて所望の緩衝液(例えば、ステップ1.13と同じ緩衝液)に保存する。冷蔵庫に保管してください。 2. トリプシン固定化ビーズ2mL(ビーズ20mg/mL)の調製 20 mLの1 mM HClを2 mLのNHS活性化アガロースビーズに加え、ビーズを洗浄します。 混合し、2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。 20 mLの0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.8)を加えます。ボルテックスミキサーと遠心分離機を使用して、2,655 × g で5分間混合します。上清を取り除きます。注:0.1 Mリン酸緩衝液(pH 7.8)の組成は、 補足表S1に記載されています。 2 mLの20 mg/mLトリプシン(トリプシンカップリング用の冷カップリングバッファーに溶解)を2 mL加えます。注:トリプシンカップリング用のカップリングバッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。 温度制御ミキサーを使用して、22°Cおよび1,100rpmで25分間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。 トリプシンビーズ調製用の修飾バッファー2 mLを加え、温度制御ミキサーを使用して22°Cおよび1,100 rpmで20分間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。注:トリプシンビーズを調製するための修飾バッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。 トリプシンビーズ調製用のブロッキングバッファー10 mLを加え、温度制御ミキサーを使用して22°Cおよび1,100 rpmで10分間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離します。上清を取り除きます。注:トリプシンビーズを調製するためのブロッキングバッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。 2 mLの保存バッファーを加え、ボルテックスミキサーを使用して混合し、使用するまで冷蔵庫に保存します。注:トリプシンビーズの保存バッファーの組成は、 補足表S1に記載されています。バッファーを冷蔵庫に保管します。 3. DSS/VAMSサンプリングとその後の乾燥血清抽出 血清をProGRP(または目的のタンパク質)で適切なレベルでスパイクして、標準物質を準備します。スパイク量を総体積の1%≤保ちます。注:ここでは、水中の295 μg/mL ProGRPのストック溶液を、添加血清標準物質の調製に使用しました。 ボルテックスミキサーで標準を混合します。 10 μLの血清(スパイクスタンダード)をDBSカードに塗布するか、メーカーのガイドラインを使用して10 μLの血清をVAMS(10 μL)で収集します。DSS の場合は、スポットが点線の円内にあることを確認します。 周囲温度で少なくとも2時間風乾させます。 スポット全体を切り取り、2 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移すか、VAMSをホルダーから取り外して2 mLの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに入れます。 1,000 μLの100 mM重炭酸アンモニウム(ABC)溶液を加えます。乾燥した血清をスポット/VAMSから1,000 rpmの温度制御ミキサーを使用して22°Cで1時間抽出します。 抽出液を新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、トリプシンタンパク質分解を行います。 4. DSS/VAMS抽出物の消化 サンプルあたり30 μLのトリプシンビーズ(セクション2で調製)を使用します。すべてのサンプルのトリプシンビーズを含むボリュームを新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、2,655 × g で5分間遠心分離し、上清を除去します。 トリプシンビーズを1 mLの冷50 mM ABCで2回洗浄してから、ピペットで取り出したのと同じ容量に再懸濁します。2,655 × g で5分間遠心分離し、ステップ間で上清を除去します。 洗浄したトリプシンビーズ30 μLを各DSS/VAMS抽出物に加え、消化を開始します。 温度制御ミキサーなどを使用して、37°Cおよび1,000rpmで2時間インキュベートします。2,655 × g で5分間遠心分離し、上清(ビーズではない)を新しい2.0 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。 安定同位体標識(SIL)ペプチドALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15 N2]を含む14 ng/mL内部標準(IS)溶液を100 mM ABC溶液に25μL加えます。 5. 抗体コート磁気ビーズを用いたプロテオタイプProGRPペプチドの捕捉 抽出ごとに20 μLの抗体コーティングビーズ(セクション1で調製した20 mg/mL)を使用します。すべての抗体コーティングビーズを新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移し、磁石の上に1分間置き、保存バッファーを除去します。 磁気抗体でコーティングされたビーズを、0.05%ポリソルベート20を含む1 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4、および2 x 1 mLのPBSで洗浄してから、ピペットで取り出したのと同じ容量に再懸濁します。ボルテックスミキサーで混合し、バッファー交換の間に1分間磁石の上に置きます。注:PBSには、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、8 mM Na 2 HPO4、および1.8 mM KH2PO4が含まれています。安定性を高めるために、10倍の濃度で溶液を調製することをお勧めします。10x PBSの100mLの組成については、補足表S1を参照してください。10x PBS 10xの希釈は、~7.4のpHを達成します。 洗浄した磁気ビーズ懸濁液20 μLを、消化されたDSS/VAMS抽出物とISを含む各低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに加えます。周囲温度でエンドオーバーエンドサンプルミキサーを使用して1時間の免疫抽出を実行します。 0.05%(v/v)ポリソルベート20を含む500 μLのPBS、400 μLのPBS、300 μLの10 mMトリス塩酸塩(pH 7.4)、および300 μLの100 mM ABC溶液を使用して磁気ビーズを洗浄します。各洗浄液を添加した後、ビーズと洗浄液が入った低タンパク質結合マイクロ遠心チューブをマグネットラックから取り出し、均一になるまで慎重に反転させます。次に、低タンパク質結合マイクロ遠心チューブを磁石に30秒間置き、30秒間反転させ、磁石に1分間置きます。洗浄液を取り除きます。 マイクロ遠心分離機を使用して残りの懸濁液をスピンダウンします。磁石の上に1分間置き、残りの洗浄液を取り除きます。 1 μLの1 H2O型ギ酸を各サンプルに加え、温度制御ミキサーなどを使用して22°C、1,000 rpmで5分間インキュベートし、捕捉されたペプチドを溶出します。磁石の上に1分間置き、溶出液を新しい1.5 mL低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。1回繰り返し、2番目の溶出液を最初の溶出液と同じ低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。 各溶出液に20 μLの100 mM ABCを加えます(総容量50 μL)。 遠心分離機(マイクロ遠心分離機)および40 μLの溶出液を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)バイアル用のマイクロインサートに移します。 6. LC-MS/MSによる分析 高い堅牢性のために、エレクトロスプレーイオン化を備えたマイクロLCトリプル四重極MSを使用してください。 移動相A(H 2 OおよびMeCN中の20 mM FA、95:5 v/v)およびB(H2OおよびMeCN中の20 mM FA、5:95 v/v)でポンプをパージすることにより、分析用のLC-MS/MSシステムを準備します。 分析カラム(C18、内径50 mm x 1 mm、粒子3 μm)を挿入します。 特定の機器の起動手順に従って、分析用の機器の準備を続けます。 装置ソフトウェアで、カラムオーブンの温度を25°Cに、流量を50 μL/min(100%移動相A)に設定します。 カラムを移動相Aで少なくとも15分間平衡化します。 サンプルをオートサンプラーに入れます。 ProGRP特異的なトリプシンペプチドALGNQQPSWDSEDSSNFKおよびそのISの分析のための装置メソッドを準備します。注:いくつかのメソッドパラメータは機器固有であり、使用する特定の機器に合わせて最適化する必要があります。ここで使用するメソッドパラメータの詳細については、ステップ 6.9 から 6.11 で説明します。 LCのグラジエントプログラムでは、次の設定を使用します:流量:50μL/分;時間0.0〜3.0分:100%移動相A;時間3.0〜18.0分:0%から50%の移動相Bまでの線形勾配を実行します。時間18.0から18.1分:移動相Bを50%から100%に増やします。時間18.1から20.0分:100%移動相B;時間20.0から20.1分:移動相Bを100%から0%に減らします。時間20.1〜30分:100%移動相Aでカラムを再平衡化します(少なくとも10カラム容量を使用)。 MS/MS設定の場合は、効率的なイオン化を保証する機器設定を使用して、MS/MSをポジティブモードで実行します。このプロトコルに従うには、+4,000 Vのスプレー電圧、270°Cの加熱キャピラリー温度、シートガスとしての窒素(任意の5ユニット)、および衝突誘起解離(CID)フラグメンテーション用のアルゴン(2 mTorr)を使用します。機器が許す場合は、MSではなく、実行の最初の2分(0〜2分)と最後の1分(29〜30分)を無駄にするようにLCフローを指示します。 (A)シグネチャペプチド(ALGNQQPSWDSEDSSNFK):1,005.45→913.3、1,005.45→1,028.3、および1,005.45→1,398.5、および(B)IS SILペプチド(ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]):1,009.45→921.3、1,009.45→1,036.3、および1,009.45→1,406.5について、選択された反応モニタリング(SRM)遷移を使用します。監視対象のすべての遷移に対して最適化された衝突エネルギー(このプロトコルでは35 V)を使用します。 LC-MS/MSシステムで利用可能なソフトウェアを使用して実行するサンプルを含むシーケンスを準備します。注入量を10μLに設定します。注意: 必要に応じて、空のサンプルと品質管理サンプルを必ず追加してください。 機器ソフトウェアの「シーケンスの実行」を押して、シーケンスを開始します。 アフィニティー捕捉されたProGRP特異的トリプシンペプチドALGNQQPSWDSEDSSNFKおよびそのIS SILペプチドのピーク面積をモニターします。注:シグネチャーペプチドALGNQPSWDSEDSSNFKの選択と確認は、他の場所に記載されています14。