מיקרו-דגימה בניתוח חלבונים ממוקד מבוסס ספקטרומטריית מסה של חלבונים בעלי שפע נמוך

סרום מתורמי דם בריאים שימש להכנת פתרונות סטנדרטיים. השימוש בסרום מתורמי דם בריאים בוצע בהתאם לחוק הנורבגי. התקבלה הסכמה מדעת מכל הנבדקים. דגימות הסרום נותחו בשיטות בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. הפרוטוקול המתואר הוא גרסה שונה של השיטה שתוארה בעבודה קודמת14. סקירה כללית של הרכב המאגרים והתמיסות ואופן הכנתם ניתן למצוא בטבלה משלימה S1, בעוד שטבלת החומרים מכילה חומרים, ציוד וריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. 1. הכנת חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים חישוב כמות הנוגדנים הדרושה להכנת מספר החרוזים הרצוי. יש להשתמש ב-1 מ”ג נוגדן לכל 50 מ”ג חרוזים מגנטיים.הערה: בדרך כלל, 20 μL של תרחיף חרוזים 20 מ”ג / מ”ל משמש לכל דגימה בניסויים הבאים (ראה שלב 5.1). חשב את נפח הנוגדנים הדרוש להכנת מספר החרוזים הרצוי.הערה: נפח הנוגדנים תלוי בריכוז הנוגדנים ויש לחשב אותו עבור כל נוגדן. העבר את הנפח הרצוי של תמיסת נוגדנים לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון 5 מ”ל. לדוגמה, אם תמיסת הנוגדנים מכילה נוגדן 1 מ”ג/מ”ל, השתמש ב-0.4 מ”ל להכנת 1.0 מ”ל של תרחיף חרוזים (20 מ”ג חרוזים/מ”ל עם 1 מ”ג נוגדן/50 מ”ג חרוזים).הערה: הנוגדנים צריכים להיות במאגר ללא אמין. השתמש בצינורות מיקרוצנטריפוגות דלות חלבון עבור כל התמיסות המכילות חלבונים כדי למנוע אובדן אנליט עקב ספיחה. הוסיפו מוט ערבוב מגנטי קטן לתמיסת הנוגדנים וכווננו את רמת החומציות ל-2.5 תוך ערבוב מתמשך. השתמש במד pH עם מיקרו אלקטרודה כדי למדוד את ה- pH ולהתאים את ה- pH על ידי הוספה מדורגת של נפחים מוגדרים של 1.0 M HCl (התחל על ידי הוספת חלקים של 10 μL של 1.0 M HCl והפחת את עוצמת הקול ככל שה- pH מתקרב ל- 2.5). רשום את הנפח הכולל של 1.0 M HCl הדרוש כדי להתאים את ה- pH ל -2.5. הסר את אלקטרודת המיקרו ודגר על הנוגדן החומצי על קרח על מערבל מגנטי למשך שעה אחת.הערה: טיפול חומצי בנוגדן מבוצע כדי לקדם את הכיוון הנכון של הנוגדנים על החרוז. ניתן להפחית את ריכוז ה-HCl ל-0.5 M או 0.2 M HCl, בהתאם לריכוז החיץ בתמיסת הנוגדנים. נטרול תמיסת הנוגדנים. השתמש במד pH עם אלקטרודת מיקרו כדי למדוד את ה- pH ולהתאים את ה- pH ל- 7 על ידי הוספה מדורגת של נפחים מוגדרים של 1.0 M NaOH (התחל עם חלק של 10 μL והפחת את הנפח ככל שה- pH מתקרב ל- 7). רשום את הנפח הכולל של 1.0 M NaOH הוסיף.הערה: ריכוז NaOH צריך להיות זהה לריכוז HCl המשמש בשלב 1.4. NaOH הוא קורוזיבי מאוד; יש להשתמש בציוד מגן, כולל כפפות והגנה מתאימה לעיניים. חשב את הנפח הרצוי של חרוזים מגנטיים מופעלים טוסיל לשימוש.הערה: בדרך כלל, מומלץ להשתמש 20 מ”ג חרוזים/מ”ל בעת ביצוע צימוד בקנה מידה קטן. יש להשתמש במינימום של 5 מ”ג חרוזים. מערבבים היטב את תרחיף החרוזים המגנטי על מערבל מערבולת ומוציאים נפח המכיל את הכמות הרצויה של תרחיף חרוזים. לדוגמה, כדי להכין 1 מ”ל של השעיית חרוזים, למשוך נפח המכיל 20 מ”ג של חרוזים (667 μL אם ריכוז החרוזים הוא 30 מ”ג / מ”ל). הניחו את מתלה החרוזים על מדף מגנטי למשך דקה אחת והוציאו את הסופרנטנט. לשטוף את החרוזים 2x עם נפח שווה של סוג 1 H2O (667 μL אם תמיסת חרוזים 30 מ”ג / מ”ל משמש להכנת 1 מ”ל של 20 מ”ג / מ”ל חרוזים מצופים נוגדנים). מערבבים באמצעות מערבל מערבולת לאחר כל תוספת של תמיסת כביסה ומניחים על המדף המגנטי למשך דקה אחת לפני הסרת הסופרנטנט. הוסף את הדברים הבאים לחרוזים המגנטיים: נוגדן מטופל בחומצה, חיץ בוראט 0.5 M (pH 9.5) (1/5 מהנפח הכולל מכיוון שהריכוז הסופי צריך להיות 0.1 M; זה שווה ל- 0.2 מ”ל להכנת 1 מ”ל של תרחיף חרוזים), ומאגר צימוד לצימוד נוגדנים (להכנת 1 מ”ל של חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים, נפח מאגר הצימוד צריך להיות שווה ל- 1 מ”ל – נפח נוגדן מטופל בחומצה – 0.2 מ”ל מאגר בוראט). מערבבים באמצעות מערבל מערבולת.הערה: נפח הנוגדן שטופל בחומצה שווה לנפח תמיסת הנוגדנים (0.4 מ”ל בהכנת 1 מ”ל של תרחיף חרוזים באמצעות תמיסת נוגדנים של 1 מ”ג/מ”ל) + נפח של 1.0 M HCl המשמש להתאמת ה- pH ל- 2.5 + נפח של 1.0 M NaOH המשמש להתאמת ה- pH ל- 7).הערה: ניתן למצוא את ההרכב של חיץ בוראט 0.5 M (pH 9.5) וחיץ צימוד לצימוד נוגדנים בטבלה משלימה S1. סובבו בטמפרטורת הסביבה למשך הלילה באמצעות מערבל דוגמיות מקצה לקצה, רצוי עם סיבוב ורטט הדדיים. צנטריפוגה למשך 10 דקות ב 239 × גרם. מניחים את הצינור על המגנט למשך 2 דקות ומסירים את הסופרנטנט. שטפו את החרוזים 2 x 2 שעות ופעם אחת למשך הלילה על ידי סיבוב במאגר האחסון לחרוזי נוגדנים בטמפרטורת הסביבה באמצעות מערבל דגימות מקצה לקצה. השתמש באותו אמצעי אחסון כמו אמצעי האחסון הכולל בשלב 1.10. מניחים את הצינור על המגנט למשך דקה אחת ומסירים את הסופרנאטנט בין כל כביסה.הערה: ניתן למצוא את הרכב מאגר האחסון עבור חרוזי נוגדנים בטבלה משלימה S1. יש לאחסן במאגר הרצוי (למשל, אותו מאגר כמו בשלב 1.13) באמצעות ריכוז המלאי הרצוי של חרוזים (בדרך כלל 20 מ”ג/מ”ל). מאחסנים במקרר. 2. הכנת 2 מ”ל של חרוזי טריפסין משותקים (20 מ”ג / מ”ל חרוזים) הוסף 20 מ”ל של 1 מ”ל HCl ל -2 מ”ל של חרוזי אגרוז המופעלים על ידי NHS כדי לשטוף את החרוזים. מערבבים וצנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant. הוסף 20 מ”ל של חיץ פוספט 0.1 M (pH 7.8). מערבבים בעזרת מערבולת מערבולת וצנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.הערה: ניתן למצוא את ההרכב של חיץ פוספט 0.1 M (pH 7.8) בטבלה משלימה S1. הוסף 2 מ”ל של 20 מ”ג/מ”ל טריפסין (מומס במאגר צימוד קר לצימוד טריפסין).הערה: ניתן למצוא את הרכב חיץ הצימוד לצימוד טריפסין בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר. יש לדגור במשך 25 דקות ב-22°C וב-1,100 סל”ד באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה. צנטריפוגה בעוצמה של 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant. הוסף 2 מ”ל של חיץ שינוי להכנת חרוזי טריפסין ודגר במשך 20 דקות ב 22 ° C ו 1,100 סל”ד באמצעות מערבל מבוקר טמפרטורה. צנטריפוגה בעוצמה של 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.הערה: הרכב חיץ השינוי להכנת חרוזי טריפסין ניתן למצוא בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר. מוסיפים 10 מ”ל של חיץ חוסם להכנת חרוזי טריפסין ודגרים במשך 10 דקות ב-22°C וב-1,100 סל”ד באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה. צנטריפוגה בעוצמה של 2,655 × גרם למשך 5 דקות. הסר את supernatant.הערה: הרכב החיץ החוסם להכנת חרוזי טריפסין ניתן למצוא בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר. מוסיפים 2 מ”ל של מאגר אחסון, מערבבים באמצעות מערבל מערבולת ומאחסנים במקרר עד לשימוש.הערה: ניתן למצוא את הרכב מאגר האחסון עבור חרוזי טריפסין בטבלה משלימה S1. אחסנו את החיץ במקרר. 3. דגימת DSS/VAMS ומיצוי לאחר מכן של סרום מיובש הכינו תקנים על ידי הקפצת הסרום עם ProGRP (או החלבון המעניין) ברמה המתאימה. שמור על נפח הזינוק ≤ 1% מעוצמת הקול הכוללת.הערה: כאן, תמיסת מלאי של 295 מיקרוגרם / מ”ל ProGRP במים שימשה להכנת תקני סרום ספייק. מערבבים את התקנים על מערבל מערבולת. יש למרוח 10 μL של סרום (תקני ספייק) על כרטיסי DBS או לאפשר איסוף של 10 μL של סרום על ידי VAMS (10 μL) באמצעות הנחיות היצרן. עבור DSS, ודא שהנקודה נמצאת בתוך העיגול המנוקד. יש לייבש באוויר בטמפרטורת הסביבה למשך שעתיים לפחות. חתכו את כל המקום והעבירו אותו לצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 2 מ”ל או הסירו את ה-VAMS מהמחזיק והניחו אותו בצינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון בנפח 2 מ”ל. הוסף 1,000 μL של 100 mM תמיסת אמוניום ביקרבונט (ABC). יש לחלץ את הסרום המיובש מהנקודה/VAMS למשך שעה אחת ב-22°C באמצעות מיקסר מבוקר טמפרטורה ב-1,000 סל”ד. העבירו את התמצית לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ”ל דל חלבון עבור פרוטאוליזה טריפטית. 4. עיכול תמציות DSS/VAMS השתמש 30 μL של חרוזי טריפסין (כפי שהוכן בסעיף 2) לכל דגימה. העבירו נפח המכיל חרוזי טריפסין לכל הדגימות לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ”ל דל חלבון, צנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות, והוציאו את הסופרנטנט. לשטוף את חרוזי טריפסין 2x עם 1 מ”ל של קר 50 mM ABC, לפני resuspending באותו נפח כי היה pipeted החוצה. צנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות ולהסיר את הסופרנאטנט בין השלבים. הוסף 30 μL של חרוזי טריפסין שטופים לכל תמצית DSS/VAMS כדי להתחיל את העיכול. יש לדגור במשך שעתיים ב-37°C וב-1,000 סל”ד באמצעות מערבל מבוקר טמפרטורה או דומה. צנטריפוגה במשקל 2,655 × גרם למשך 5 דקות ומעבירים את הסופרנאטנט (לא חרוזים) לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בנפח 2.0 מ”ל דל חלבון. הוסף 25 μL של 14 ng/mL תמיסת תקן פנימית (IS) המכילה את הפפטיד ALGNQQQPSWDSEDSSNF [K_13C6_15N2] בתמיסת ABC של 100 mM. 5. לכידת פפטיד ProGRP פרוטאוטיפי באמצעות חרוזים מגנטיים מצופים נוגדנים יש להשתמש ב-20 מיקרוליטר של חרוזים מצופים נוגדנים (20 מ”ג/מ”ל כפי שהוכן בסעיף 1) לכל מיצוי. העבירו את כל החרוזים המצופים בנוגדנים לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ”ל עם קשירת חלבונים נמוכה, הניחו על המגנט למשך דקה אחת והסירו את מאגר האחסון. שטפו את החרוזים המצופים בנוגדנים מגנטיים עם 1 מ”ל של מלח חוצץ פוספט (PBS), pH 7.4, המכיל 0.05% פוליסורבט 20, ו-2 x 1 מ”ל של PBS לפני השעיה מחדש באותו נפח שהוצא החוצה. מערבבים על מערבל מערבולת ומניחים על המגנט למשך דקה אחת בין חילופי חיץ.הערה: PBS מכיל 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4ו- 1.8 mM KH2PO4. מומלץ להכין את התמיסה בריכוז של פי 10 ליציבות מוגברת. להרכב של 100 מ”ל של 10x PBS, ראה טבלה משלימה S1. דילול של 10x PBS 10x ישיג pH של ~7.4. הוסף 20 μL של תרחיף חרוזים מגנטי שטוף לכל צינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון המכיל תמצית DSS/VAMS מעוכלת ו- IS. בצעו מיצוי חיסוני במשך שעה באמצעות מערבל דגימות מקצה לקצה בטמפרטורת הסביבה. שטפו את החרוזים המגנטיים באמצעות התמיסות הבאות: 500 μL של PBS עם 0.05% (v/v) פוליסורבט 20, 400 μL של PBS, 300 μL של 10 mM Tris HCl (pH 7.4), ו-300 μL של 100 mM ABC.לאחר הוספת כל תמיסת שטיפה, הסר את צינור המיקרוצנטריפוגה דל החלבון עם חרוזים ותמיסת שטיפה ממדף המגנטים והפוך בזהירות עד להומוגני. לאחר מכן, הניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה דל החלבון על המגנט למשך 30 שניות, הפכו למשך 30 שניות והניחו על המגנט למשך דקה אחת. הסירו את תמיסת הכביסה. סובבו מטה את המתלים הנותרים באמצעות מיקרוצנטריפוגה. מניחים על המגנט למשך דקה אחת ומסירים את תמיסת הכביסה שנותרה. הוסף 15 μL של 2% (v/v) חומצה פורמית מסוג 1 H2O לכל דגימה ודגרה במשך 5 דקות ב 22 ° C ו 1,000 סל”ד באמצעות מערבל מבוקר טמפרטורה, או דומה, כדי לנטרל את הפפטידים שנלכדו. מניחים על המגנט למשך דקה אחת ומעבירים את הפולט לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מ”ל בעל קשירת חלבונים נמוכה. חזור על הפעולה פעם אחת והעבר את הפולט השני לאותו צינור מיקרוצנטריפוגה דל חלבון כמו הראשון. הוסף 20 μL של 100 mM ABC לכל פליטה (נפח כולל של 50 μL). צנטריפוגה (מיקרוצנטריפוגה) ולהעביר 40 μL של eluate למיקרו תוספות עבור בקבוקונים של כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) בעלי ביצועים גבוהים. 6. ניתוח על ידי LC-MS/MS השתמש ב- micro LC triple quadrupole MS עם יינון אלקטרוספריי לחוסן גבוה. הכן את מערכת LC-MS/MS לניתוח על ידי ניקוי המשאבות עם שלב A נייד (20 mM FA ב- H 2 O ו- MeCN, 95: 5 v/v) ו- B (20 mM FA ב- H2O ו- MeCN, 5: 95 v/v). הכנס את העמודה האנליטית (C18, קוטר פנימי של 50 מ”מ x 1 מ”מ [ID], חלקיקי 3 מיקרומטר). המשך להכין את המכשיר לניתוח על ידי ביצוע הליכי ההפעלה של המכשיר הספציפי. בתוכנת המכשיר, הגדר את טמפרטורת תנור העמודים ל- 25 מעלות צלזיוס ואת קצב הזרימה ל- 50 מיקרוליטר לדקה (100% שלב A נייד). אזן את העמודה עם שלב A נייד למשך 15 דקות לפחות. מקם את הדגימות בדוגם האוטומטי. הכן את שיטת המכשיר לניתוח של הפפטיד הטריפטי הספציפי ל- ProGRP ALGNQQPSWDSEDSSNFK, וה- IS.הערה: מספר פרמטרים של שיטה הם ספציפיים למכשיר ויש למטב אותם במכשיר הספציפי שבו נעשה שימוש. פרטים על פרמטרי השיטה המשמשים כאן מתוארים בשלבים 6.9 עד 6.11. עבור תוכנית השיפוע ב- LC, השתמש בהגדרות הבאות: קצב זרימה: 50 מיקרוליטר לדקה; מזמן 0.0 עד 3.0 דקות: 100% נייד שלב A; מזמן 3.0 עד 18.0 דקות: הפעל מעבר צבע ליניארי מ- 0% ל- 50% שלב B נייד; מזמן 18.0 עד 18.1 דקות: הגדל את שלב B הנייד מ- 50% ל- 100%; מזמן 18.1 עד 20.0 דקות: 100% נייד שלב B; מזמן 20.0 עד 20.1 דקות: הפחתת שלב B נייד מ- 100% ל- 0%; מזמן 20.1 עד 30 דקות: 100% נייד שלב A כדי לאזן מחדש את העמודה (השתמש באמצעי אחסון של 10 עמודות לפחות). עבור הגדרות MS/MS, הפעל את MS/MS במצב חיובי באמצעות הגדרות התקן המבטיחות יינון יעיל. כדי לעקוב אחר פרוטוקול זה, השתמש במתח ריסוס של +4,000 V, טמפרטורת נימים מחוממת של 270 ° C, חנקן כגז גיליון (5 יחידות שרירותיות), וארגון (2 mTorr) עבור פיצול דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות (CID). אם המכשיר מאפשר, כוון את זרימת ה- LC לבזבז את 2 הדקות הראשונות (0-2 דקות) ואת הדקה האחרונה (29-30 דקות) של הריצה, במקום לתוך MS. השתמש במעברי ניטור תגובה נבחרים (SRM) עבור (A) פפטיד החתימה (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1,005.45→913.3, 1,005.45→1,028.3 ו- 1,005.45→1,398.5, וכן (B) פפטיד IS SIL (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6_15N2]): 1,009.45→921.3, 1,009.45→1,036.3 ו- 1,009.45→1,406.5. השתמש באנרגיית התנגשות ממוטבת (35 V בפרוטוקול זה) עבור כל המעברים המנוטרים. הכן רצף המכיל את הדגימות שיופעלו באמצעות התוכנה הזמינה עבור מערכת LC-MS/MS. הגדר את נפח ההזרקה ל- 10 μL.הערה: הקפד להוסיף דוגמאות ריקות ודוגמאות בקרת איכות לפי הצורך. לחץ על “הפעל רצף” בתוכנת המכשיר כדי להתחיל את הרצף. נטר את אזור השיא של הפפטיד הטריפטי ALGNQQQPSWDSSNFK שנלכד על ידי זיקה, ספציפי ל-ProGRP, ופפטיד IS SIL שלו.הערה: בחירה ואישור של פפטיד החתימה, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, מתואר במקום אחר14.