Ablación con láser multifotón de centros organizadores de microtúbulos citoplasmáticos en ovocitos de ratón

Todos los métodos descritos aquí fueron aprobados por la Universidad de Missouri (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). En el presente estudio se utilizaron ratones hembra reporteros Cep192-eGFP de 6 a 8 semanas de edad. Para generar ratones reporteros Cep192-eGFP , se utilizó la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR / Cas9 para integrar el gen reportero EGFP en el genoma del ratón CF-1. El reportero del EGFP se fusionó en el extremo C del CEP192 (un componente integral de los MTOC)15. Para mantener la colonia de ratones, se utilizaron ratones reporteros homocigotos Cep192-eGfp . Todos los animales se mantuvieron en jaulas (hasta cuatro animales/jaula) a 21 °C y 55% de humedad, con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y acceso ad libitum a alimentos y agua. 1. Recolección de ovocitos de ratón Preparar el medio de cultivo (Chatot, Ziomek y Bavister, CZB19, ver la Tabla de materiales) e incubarlo a 37 °C y 5% deCO2 durante la noche.NOTA: El medio CZB puede almacenarse a 4 °C durante 1 mes (consulte el archivo complementario 1 para la composición del soporte). Complemente el medio CZB con glutamina (1 mM) y milrinona (2.5 mM) (CZB + M) (ver Tabla de materiales), y colóquelo en la incubadora.NOTA: La milrinona es un inhibidor de la fosfodiesterasa que mantiene los ovocitos detenidos en la profase I y previene la reanudación meiótica20. Prepare el medio de recolección (medio esencial mínimo libre de bicarbonato, MEM) que contiene 3 mg/ml de polivinilpirodona (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (Archivo complementario 1) y milrinona (2.5 mM) (MEM/PVP + M, consulte la Tabla de materiales). Prepare las placas de recolección y cultivo, haga cuatro microgotas (100 μL) de medio de recolección (MEM / PVP + M) y dos microgotas (100 μL) de medio de cultivo (CZB + M) en placas de Petri de 60 mm y 35 mm, respectivamente, y cúbralas con aceite mineral (ver Tabla de materiales). Mantenga el plato de recolección en el calentador de portaobjetos y coloque el plato de cultivo en la incubadora a 37 °C y 5% deCO2. Inyecte por vía intraperitoneal 5 UI de gonadotropina sérica de yegua embarazada (PMSG, consulte la Tabla de materiales) en ratones hembra reporteros Cep192-eGFP sexualmente maduros (6-8 semanas de edad) 44-48 h antes de la recolección de ovocitos. Sacrificar los ratones por luxación cervical, identificar y extraer los ovarios21, y transferirlos a un cristal de reloj que contenga medio de recolección precalentado (MEM/PVP + M) a 37 °C. Fije el ovario tocando una jeringa de 1 ml en el fondo del vidrio del reloj y perforándolo varias veces (~ 40 veces por ovario) con agujas de coser agrupadas para liberar los ovocitos en el medio. Utilizando una pipeta de transferencia de plástico, transfiera todo el medio que contiene los complejos cúmulo-ovocitos (AOC) del paso 1.7 a una placa de Petri de plástico vacía de 100 mm. Bajo un microscopio estereoscópico, recoja los AOC con una pipeta de vidrio Pasteur y transfiéralos al plato de recolección que contenga MEM/PVP + M. Con una pipeta de vidrio Pasteur estrecha (aproximadamente 100 μm de diámetro), desnudar los ovocitos mecánicamente mediante un suave pipeteo repetitivo, seguido de transferirlos y lavarlos en cuatro microgotas de (100 μL) MEM/PVP + M (la placa de recolección) antes de su transferencia a la placa de cultivo CZB + M. Incubar los ovocitos desnudos durante 1 h a 37 °C con un 5% deCO2 en el aire. 2. Microinyección de ovocitos Coloque una gota de 250 μL de MEM/PVP + M en una tapa de placa de Petri de plástico de 100 mm y cúbrala con aceite mineral.NOTA: La tapa de la placa de Petri tiene un borde inferior que proporciona más espacio para ajustar el micromanipulador. Encienda el sistema de microinyección (consulte la Tabla de materiales). Coloque la placa de microinyección en la etapa de calentamiento (37 °C) del microscopio. Cargue la aguja de inyección con 0,5 μL de ARNc mCh-Cep192utilizando puntas de pipeta de microcargador (consulte la Tabla de materiales) y fije la aguja de inyección al micromanipulador. Transfiera los ovocitos desnudos (paso 1.11) a la microgota de 250 μL (paso 2.1). Bajo una lente de objetivo 20x o 40x, ajuste la posición y el enfoque de las agujas de inyección y sujeción de acuerdo con la posición del ovocito (Figura 1). Configure la unidad de microinyección y establezca la presión de inyección (p i), la presión de compensación (pc) y el tiempo de inyección (ti) para poder inyectar 5-10 pl de ARNc mCh-Cep192 (para etiquetar exógenamente los MTOC). Inyectar cuidadosamente los ovocitos sin tocar el núcleo. Una vez inyectados todos los ovocitos, lavarlos en tres microgotas de CZB+M, transferirlos a la placa de cultivo (CZB+M), e incubarlos durante 3 h a 37 °C para permitir la expresión de mCh-Cep192. 3. Maduración de los ovocitos Preparar el medio de maduración añadiendo glutamina (1 mM) al medio CZB preequilibrado en una incubadora con un 5% deCO2 en el aire a 37 °C durante al menos 3 h. Hacer dos microgotas (100 μL) del medio de maduración en una placa de Petri de 35 mm, y cubrirlas con aceite mineral (placa de maduración). Lave los ovocitos detenidos con profase I al menos tres veces en microgotas CZB sin milrinona de 100 μL para eliminar completamente la milrinona y permitir la reanudación meiótica. Transfiera los ovocitos a la placa de maduración e incube durante 5 h (etapa prometafase I) en una incubadora humidificada con 5% deCO2 en el aire a 37 °C. 4. Preparación de ovocitos para ablación e imagen Transferir los ovocitos de prometafase I (paso 3.4) a una placa de cultivo con fondo de vidrio que contenga 100 μL de medio de maduración (paso 3.1) cubierta con aceite mineral. 5. Preparación del microscopio para la ablación Al menos 30 minutos antes de la ablación, encienda el regulador de temperatura de la incubadora de escenarios (consulte la Tabla de materiales) y configúrelo a 37 °C. Encienda el controlador de CO2 y configúrelo en 5% deCO2. Seleccione un objetivo apocromático de inmersión en aceite 40x y aplique una pequeña gota del aceite de inmersión. Monte el plato de cultivo con fondo de vidrio con los ovocitos en una incubadora de etapa y cubra la incubadora con una tapa de gas. En el software de adquisición de imágenes (consulte la Tabla de materiales), seleccione una opción que permita guardar varias posiciones de etapa (por ejemplo, “Definir marcar y encontrar experimento”). Usando iluminación de campo claro de luz transmitida, céntrate en los ovocitos individuales y guarda sus posiciones. En el software de adquisición de imágenes, seleccione el modo de escaneo XYZ , establezca el formato de imagen en 256 x 256 píxeles, establezca el factor de zoom en 2.5x – 3.0x y seleccione una frecuencia de escaneo de 600 Hz. Esto corresponde a un tiempo de permanencia de píxeles de aproximadamente 1,6 μs. Establezca una línea láser de excitación de 488 nm a aproximadamente el 10% de la potencia del láser (que corresponde a 4.0 μW a nivel de muestra) (consulte la Tabla de materiales) y use un ancho de banda espectral de 500-550 nm para observar la señal GFP de los MTOC. Para la observación simultánea de la fluorescencia del Cep192 marcado con mCherry, configure una línea láser de excitación de 585 nm en aproximadamente el 8% de la potencia del láser (que corresponde a 10.7 μW a nivel de muestra) y use otro detector configurado con un ancho de banda espectral de 595-645 nm.NOTA: Es útil utilizar el detector de luz transmitida (TLD) del microscopio confocal para detectar simultáneamente los límites de los ovocitos. Usando un modo de escaneo en vivo y el control manual del z-drive, examine el ovocito en busca de MTOC. Una vez que se detecta un mcMTOC, dibuje una región cuadrada de interés (ROI) a su alrededor. 6. Ablación de mcMTOCs Ajuste un láser de femtosegundo a una longitud de onda de 740 nm.NOTA: La longitud de onda del láser se puede cambiar de acuerdo con el microscopio y las condiciones del láser. Utilice el modulador electroóptico del microscopio multifotón (consulte la Tabla de materiales) para ajustar la potencia del láser al 70% -80%, correspondiente a la potencia de 60-70 mW en el plano de muestra.NOTA: Si el láser está equipado con un compensador de pulso de femtosegundo, utilícelo para corregir la dispersión de retardo de grupo (GDD). La corrección GDD reduce la cantidad de potencia láser requerida para una ablación mcMTOC eficiente y minimiza el fotodaño al ovocito. El control GDD generalmente se integra con el software de adquisición de imágenes de microscopios multifotónicos comerciales. Utilice el mismo formato de imagen, factor de zoom y frecuencia de escaneo que en el paso 5.6. Establezca los parámetros de promedio de línea y fotograma en 1. Haga clic en el botón Escanear en el software para realizar la ablación del mcMTOC realizando un solo escaneo láser del ROI seleccionado. Utilice la configuración de canal del paso 5.7 para revisar los resultados de la ablación comparando las imágenes de las estructuras marcadas con GFP tomadas antes y después de la exposición al láser multifotón. Si la ablación es exitosa, la intensidad de la fluorescencia GFP en el mcMTOC objetivo disminuye a los niveles observados en el fondo. Si quedan algunos fragmentos de una estructura de etiquetado GFP, repita el paso 6.4 una o más veces centrándose en varios planos z del mcMTOC. Utilice la configuración de canal del paso 5.7 para verificar la eficiencia de ablación mediante la pérdida completa de señales mCherry asociadas a mcMTOC (mCh-Cep192). Repita los pasos 5.8 a 6.7 hasta que se ablacionen todos los MTOC de un ovocito (en varios planos focales).NOTA: Este protocolo utiliza la microinyección mCh-Cep192 como estrategia para confirmar el agotamiento de mcMTOC después de la exposición al láser multifotón y excluir la posibilidad de que la pérdida de fluorescencia GFP sea causada por el fotoblanqueo de GFP. Sin embargo, la microinyección de esta sonda es opcional y no es necesaria para el procedimiento de ablación.