אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי אוניברסיטת מיזורי (הבטחת איכות לטיפול בבעלי חיים מספר 9695). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברות בנות 6-8 שבועות של Cep192-eGFP . כדי ליצור עכברי כתב Cep192-eGFP , נעשה שימוש בתיקון מונחה הומולוגיה בתיווך CRISPR/Cas9 כדי לשלב את הגן המדווח EGFP בגנום העכבר CF-1. כתב ה-EGFP התמזג ב-C-terminus של Cep192 (מרכיב אינטגרלי של MTOCs)15. כדי לתחזק את מושבת העכברים, נעשה שימוש בעכברי כתב Cep192-eGfp . כל בעלי החיים הוחזקו בכלובים (עד ארבע חיות / כלוב) ב 21 מעלות צלזיוס ו -55% לחות, עם מחזור אור / חושך של 12 שעות וגישה ad libitum למזון ומים. 1. אוסף ביצית עכבר הכינו את מדיום התרבית (צ’אטו, זיומק ובאביסטר, CZB19, ראו טבלת החומרים), ודגרו אותו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך הלילה.הערה: ניתן לאחסן את המדיום CZB בטמפרטורה של 4 °C למשך חודש אחד (ראה קובץ משלים 1 להרכב המדיה). הוסיפו למדיום CZB גלוטמין (1 מ”מ) ומילרינון (2.5 מ”מ) (CZB + M) (ראו טבלת חומרים), והניחו אותו באינקובטור.הערה: מילרינון הוא מעכב פוספודיאסטראז השומר על הביציות שנעצרו בפרופזה I ומונע חידוש מיוטי20. הכן את מדיום האיסוף (מדיום חיוני מינימלי ללא ביקרבונט, MEM) המכיל 3 מ”ג/מ”ל פוליוויניל פירולידון (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (קובץ משלים 1), ומילרינון (2.5 mM) (MEM/PVP + M, ראה טבלת החומרים). הכינו את כלי האיסוף והתרבית, הכינו ארבע מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום איסוף (MEM/PVP + M) ושתי מיקרו-טיפות (100 μL) של תרבית (CZB + M) בינוניות בצלחות פטרי בקוטר 60 מ”מ ו-35 מ”מ, בהתאמה, וכסו אותן בשמן מינרלי (ראו טבלת חומרים). שמור את צלחת האיסוף על שקופית חמה יותר, והכניס את צלחת התרבית לחממה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2. יש להזריק תוך צפק 5 יחב”ל של גונדוטרופין בסרום של סוסה הרה (PMSG, ראו טבלת חומרים) לעכברות בוגרות מינית (בנות 6-8 שבועות) Cep192-eGFP 44-48 שעות לפני איסוף הביציות. להקריב את העכברים על ידי נקע צוואר הרחם, לזהות ולהסיר את השחלות21, ולהעביר אותם לתוך זכוכית שעון המכילה אמצעי איסוף מראש (MEM / PVP + M) ב 37 מעלות צלזיוס. מקבעים את השחלה על ידי נגיעה במזרק של 1 מ”ל בתחתית זכוכית השעון ומנקבים אותו מספר פעמים (~ 40 פעמים לכל שחלה) באמצעות מחטי תפירה המחוברות יחד כדי לשחרר את הביציות למדיום. באמצעות פיפט העברת פלסטיק, מעבירים את כל המדיום המכיל את קומפלקסי הקומולוס-ביצית (COCs) משלב 1.7 לתוך צלחת פטרי פלסטיק ריקה בקוטר 100 מ”מ. תחת סטריאומיקרוסקופ, אספו את ה-COCs באמצעות פיפט זכוכית פסטר, והעבירו אותם לצלחת האיסוף המכילה MEM/PVP + M. באמצעות פיפט זכוכית פסטר צר (בקוטר של כ-100 מיקרומטר), מפרקים את הביציות באופן מכני על ידי פיפטציה עדינה שחוזרת על עצמה, ולאחר מכן מעבירים ושוטפים אותן בארבע טיפות מיקרו של (100 μL) MEM/PVP + M (צלחת האיסוף) לפני העברתן לצלחת התרבית CZB + M. לדגום את הביציות denuded במשך 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% של CO2 באוויר. 2. מיקרו הזרקת ביציות הכניסו טיפה של 250 μL של MEM/PVP + M לתוך מכסה צלחת פטרי מפלסטיק בקוטר 100 מ”מ, וכסו אותה בשמן מינרלי.הערה: מכסה צלחת פטרי כולל שפה תחתונה המספקת יותר מקום להתאמת המיקרומניפולטור. הפעל את מערכת המיקרו-הזרקות (ראה טבלת החומרים). מניחים את צלחת המיקרו-הזרקה על שלב ההתחממות (37 מעלות צלזיוס) של המיקרוסקופ. טען את מחט ההזרקה עם 0.5 μL של mCh-Cep192cRNA באמצעות קצוות פיפטה microloader (ראה טבלת חומרים), והצמיד את מחט ההזרקה למיקרומניפולטור. מעבירים את הביציות המנודות (שלב 1.11) למיקרודרופ 250 μL (שלב 2.1). תחת עדשה אובייקטיבית של 20x או 40x, התאימו את המיקום ואת המיקוד של ההזרקה ומחטי ההחזקה בהתאם לתנוחת הביציות (איור 1). הגדר את יחידת המיקרו-הזרקה, והגדר את לחץ ההזרקה (p i), לחץ הפיצוי (pc) וזמן ההזרקה (ti) כך שיוכלו להזריק 5-10 pl של mCh-Cep192 cRNA (כדי לסמן באופן אקסוגני את ה- MTOCs). בזהירות להזריק את הביציות מבלי לגעת בגרעין. לאחר הזרקת כל הביציות, שטפו אותן בשלוש טיפות מיקרו של CZB + M, העבירו אותן לצלחת התרבית (CZB + M), ודגרו אותן במשך 3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר ביטוי mCh-Cep192. 3. הבשלת ביציות הכן את מדיום ההבשלה על ידי הוספת גלוטמין (1 מ”מ) למדיום CZB בשיווי משקל מראש באינקובטור עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות לפחות. מכינים שתי מיקרו-טיפות (100 μL) של מדיום ההבשלה בצלחת פטרי בקוטר 35 מ”מ, ומכסים אותן בשמן מינרלי (צלחת הבשלה). יש לשטוף לפחות שלוש פעמים במיקרו-טיפות CZB נטולות 100 μL כדי להסיר לחלוטין את המילרינון ולאפשר חידוש מיוטי. מעבירים את הביציות לצלחת ההבשלה, ודוגרים אותן במשך 5 שעות (שלב Prometaphase I) באינקובטור לח עם 5% CO2 באוויר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. 4. הכנת ביציות לאבלציה והדמיה מעבירים את הביציות של Prometaphase I (שלב 3.4) לצלחת תרבית עם תחתית זכוכית המכילה 100 μL של מדיום הבשלה (שלב 3.1) מכוסה בשמן מינרלי. 5. הכנת מיקרוסקופ לאבלציה לפחות 30 דקות לפני אבלציה, הפעל את בקר הטמפרטורה של חממת הבמה (ראה טבלת חומרים) והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. הפעל את בקר CO 2 והגדר אותו ל- 5% CO2. בחרו מטרה אפוכרומטית של טבילת שמן פי 40, ומרחו טיפה קטנה משמן הטבילה. הרכיבו את צלחת התרבית בעלת תחתית הזכוכית עם הביציות על אינקובטור עליון, וכיסו את האינקובטור במכסה גז. בתוכנת רכישת התמונה (ראו טבלת חומרים), בחרו אפשרות המאפשרת שמירה של מיקומי במה מרובים (לדוגמה, “הגדר סימן ומצא ניסוי”). באמצעות תאורת אור המועברת, מרכז על הביציות הבודדות ושמור את מיקומן. בתוכנת רכישת התמונות, בחר את מצב הסריקה XYZ , הגדר את פורמט התמונה ל- 256 x 256 פיקסלים, הגדר את גורם הזום ל- 2.5x – 3.0x ובחר תדר סריקה של 600 הרץ. זה מתאים לזמן השהייה של פיקסל של כ-1.6 μs. הגדר קו לייזר עירור של 488 ננומטר בכ-10% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-4.0 מיקרו-וואט ברמת הדגימה) (ראו טבלת חומרים), והשתמש ברוחב פס ספקטרלי של 500-550 ננומטר כדי לצפות באות GFP מה-MTOCs. לתצפית סימולטנית של פלואורסצנציה מ- Cep192 המתויג mCherry, הגדר קו לייזר עירור של 585 ננומטר בכ-8% מעוצמת הלייזר (המתאימה ל-10.7 μW ברמת הדגימה), והשתמש בגלאי אחר שנקבע לרוחב פס ספקטרלי של 595-645 ננומטר.הערה: כדאי להשתמש בגלאי האור המועבר (TLD) של המיקרוסקופ הקונפוקלי לגילוי גבולות ביציות בו-זמנית. באמצעות מצב סריקה חי ושליטה ידנית של כונן z, מסך את הביצית עבור MTOCs. לאחר זיהוי mcMTOC, צייר סביבו אזור מרובע של עניין (ROI). 6. אבלציה של mcMTOCs הגדר לייזר פמטו-שניות לאורך גל של 740 ננומטר.הערה: ניתן לשנות את אורך גל הלייזר בהתאם למיקרוסקופ ולתנאי הלייזר. השתמש במודולטור האלקטרו-אופטי של המיקרוסקופ הרב-פוטוני (ראו טבלת חומרים) כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ל-70%-80%, המתאימה להספק של 60-70 mW במישור הדגימה.הערה: אם הלייזר מצויד במפצה דופק femtosecond, השתמש בו כדי לתקן פיזור עיכוב קבוצתי (GDD). תיקון GDD מפחית את כמות כוח הלייזר הנדרשת לאבלציה יעילה של mcMTOC וממזער את הנזק לביצית. בקרת GDD משולבת בדרך כלל עם תוכנת רכישת התמונה של מיקרוסקופים מסחריים מרובי פוטונים. השתמש באותו פורמט תמונה, מקדם זום ותדירות סריקה כמו בשלב 5.6. הגדר את הפרמטרים לממוצע של קו ומסגרת ל- 1. לחץ על כפתור הסריקה בתוכנה כדי לבצע את האבלציה של mcMTOC על ידי ביצוע סריקת לייזר אחת של החזר ההשקעה שנבחר. השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לסקור את תוצאות האבלציה על-ידי השוואת התמונות של המבנים בעלי תווית GFP שצולמו לפני ואחרי החשיפה ללייזר מרובה פוטונים. אם האבלציה מצליחה, עוצמת הפלואורסצנציה של GFP ב-mcMTOC הממוקד יורדת לרמות שנצפו ברקע. אם נותרו כמה קטעים ממבנה תיוג GFP, חזור על שלב 6.4 פעם אחת או יותר על-ידי התמקדות במישורי z שונים של ה-mcMTOC. השתמש בהגדרות הערוץ משלב 5.7 כדי לאמת את יעילות האבלציה על-ידי אובדן מוחלט של אותות mCherry הקשורים ל-mcMTOC (mCh-Cep192). חזור על שלב 5.8 לשלב 6.7 עד שכל ה- MTOCs של ביצית (במישורי מוקד שונים) יתבטלו.הערה: פרוטוקול זה משתמש במיקרו-הזרקה mCh-Cep192 כאסטרטגיה לאישור דלדול mcMTOC בעקבות חשיפה ללייזר מרובה פוטונים ולא כולל את האפשרות שאובדן פלואורסצנציה של GFP נגרם על ידי הלבנת תמונות GFP. עם זאת, המיקרו-הזרקה של בדיקה זו היא אופציונלית ואינה נדרשת להליך האבלציה.