Fare Oositlerinde Sitoplazmik Mikrotübül Düzenleme Merkezlerinin Multi-Foton Lazer Ablasyonu

Burada açıklanan tüm yöntemler Missouri Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (Hayvan Bakımı Kalite Güvencesi Referans Numarası 9695). Bu çalışmada 6-8 haftalık Cep192-eGFP muhabiri dişi fareler kullanılmıştır. Cep192-eGFP muhabir fareleri üretmek için, EGFP muhabir genini CF-1 fare genomuna entegre etmek için CRISPR / Cas9 aracılı homoloji yönelimli onarım kullanıldı. EGFP muhabiri, Cep192’nin (MTOC’lerin ayrılmaz bir bileşeni) C-ucunda kaynaştırıldı15. Fare kolonisini korumak için, homozigot Cep192-eGfp muhabir fareleri kullanıldı. Tüm hayvanlar, 21 ° C ve% 55 nemde, 12 saatlik açık / karanlık döngü ve yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile kafeslerde (dört hayvana / kafese kadar) tutuldu. 1. Fare oosit koleksiyonu Kültür ortamını hazırlayın (Chatot, Ziomek ve Bavister, CZB19, Malzeme Tablosuna bakın) ve gece boyunca 37 ° C ve% 5 CO2’de inkübe edin.NOT: CZB ortamı 1 ay boyunca 4 °C’de saklanabilir (ortam kompozisyonu için Ek Dosya 1’e bakınız). CZB ortamını glutamin (1 mM) ve milrinon (2,5 mM) (CZB + M) ile destekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve inkübatöre yerleştirin.NOT: Milrinon, faz I’de tutuklanan oositleri koruyan ve mayotik yeniden başlama20’yi önleyen bir fosfodiesteraz inhibitörüdür. 3 mg/mL polivinilpirolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7.3) (Ek Dosya 1) ve milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M) içeren toplama ortamını (bikarbonatsız minimal esansiyel ortam, MEM) hazırlayın. Toplama ve kültür yemeklerini hazırlayın, sırasıyla 60 mm ve 35 mm Petri kaplarında dört mikrodamla (100 μL) toplama ortamı (MEM / PVP + M) ve iki mikrodamla (100 μL) kültür (CZB + M) ortamı yapın ve bunları mineral yağ ile örtün (bkz. Toplama kabını kaydırakta daha sıcak tutun ve kültür kabını inkübatöre 37 ° C ve% 5 CO2’de koyun. İntraperitoneal olarak 5 IU hamile kısrak serum gonadotropini (PMSG, Materyaller Tablosuna bakınız) cinsel olarak olgun (6-8 haftalık) Cep192-eGFP muhabiri dişi farelere oosit toplanmasından 44-48 saat önce enjekte edin. Fareleri servikal çıkık ile kurban edin, yumurtalıkları tanımlayın ve çıkarın21 ve bunları 37 ° C’de önceden ısıtılmış toplama ortamı (MEM / PVP + M) içeren bir saat camına aktarın. Saat camının dibine 1 mL’lik bir şırıngaya dokunarak ve yumurtaları ortama bırakmak için bir araya getirilmiş dikiş iğnelerini kullanarak birkaç kez (yumurtalık başına ~ 40 kez) delerek yumurtalığı sabitleyin. Plastik bir transfer pipeti kullanarak, kümülüs-oosit komplekslerini (COC’ler) içeren tüm ortamları adım 1.7’den boş bir 100 mm plastik Petri kabına aktarın. Bir stereomikroskop altında, COC’leri bir Pasteur cam pipet kullanarak toplayın ve bunları MEM / PVP + M içeren toplama kabına aktarın. Dar bir Pasteur cam pipet (yaklaşık 100 μm çapında) kullanarak, oositleri nazik tekrarlayan pipetleme ile mekanik olarak denüde edin, ardından CZB + M kültür kabına aktarılmadan önce dört mikrodamla (100 μL) MEM / PVP + M (toplama kabı) içinde aktarın ve yıkayın. İnkar edilen oositleri 37 ° C’de 1 saat boyunca havada CO2’nin % 5’i ile inkübe edin. 2. Yumurta mikroenjeksiyonu 100 mm’lik plastik Petri kabı kapağına 250 μL’lik bir MEM/PVP + M damlası yerleştirin ve mineral yağ ile örtün.NOT: Petri çanak kapağı, mikromanipülatörün ayarlanması için daha fazla alan sağlayan daha düşük bir kenara sahiptir. Mikroenjeksiyon sistemini açın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Mikroenjeksiyon kabını mikroskobun ısınma aşamasına (37 °C) yerleştirin. Enjeksiyon iğnesini mikroyükleyici pipet uçlarını kullanarak 0,5 μL mCh-Cep192cRNA ile yükleyin ( bkz. Malzeme Tablosu) ve enjeksiyon iğnesini mikromanipülatöre sabitleyin. Reddedilen oositleri (adım 1.11) 250 μL mikrodamlaya (adım 2.1) aktarın. 20x veya 40x objektif lens altında, enjeksiyon ve tutma iğnelerinin konumunu ve odağını oosit pozisyonuna göre ayarlayın (Şekil 1). Mikroenjeksiyon ünitesini kurun ve 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA enjekte edebilmek için enjeksiyon basıncını (pi), kompanzasyon basıncını (p c) ve enjeksiyon süresini (ti) ayarlayın (MTOC’leri eksojen olarak etiketlemek için). Çekirdeğe dokunmadan yumurtaları dikkatlice enjekte edin. Tüm yumurtalar enjekte edildikten sonra, üç mikrodamla CZB + M içinde yıkayın, kültür kabına (CZB + M) aktarın ve mCh-Cep192 ekspresyonuna izin vermek için 37 ° C’de 3 saat boyunca inkübe edin. 3. Yumurta olgunlaşması Olgunlaşma ortamını, en az 3 saat boyunca 37 ° C’de havada% 5 CO2 bulunan bir inkübatörde önceden dengelenmiş CZB ortamına glutamin (1 mM) ekleyerek hazırlayın. 35 mm’lik bir Petri kabında olgunlaşma ortamının iki mikrodamlasını (100 μL) yapın ve bunları mineral yağ (olgunlaşma kabı) ile örtün. Milrinonu tamamen çıkarmak ve mayotik yeniden başlamaya izin vermek için faz I ile tutuklanmış oositleri 100 μL milrinon içermeyen CZB mikrodamlalarında en az üç kez yıkayın. Yumurtaları olgunlaşma kabına aktarın ve 37 ° C’de havada% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde 5 saat (prometafaz I aşaması) inkübe edin. 4. Ablasyon ve görüntüleme için oosit hazırlığı Prometafaz I oositlerini (adım 3.4), mineral yağ ile kaplı 100 μL olgunlaşma ortamı (adım 3.1) içeren cam tabanlı bir kültür kabına aktarın. 5. Ablasyon için mikroskop hazırlığı Ablasyondan en az 30 dakika önce, sahne inkübatörü için sıcaklık kontrol cihazını açın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C’ye ayarlayın. CO2 kontrol cihazını açın ve %5 CO2 olarak ayarlayın. 40x yağ daldırma apokromatik hedefi seçin ve daldırma yağından küçük bir damla uygulayın. Cam tabanlı kültür kabını oositlerle birlikte bir sahne üstü inkübatöre monte edin ve inkübatörü bir gaz kapağıyla örtün. Görüntü alma yazılımında ( bkz. Malzeme Tablosu), birden fazla aşama konumunun kaydedilmesini sağlayan bir seçenek belirleyin (örneğin; “İşareti tanımla ve deneyi bul”). İletilen ışık parlak alan aydınlatmasını kullanarak, bireysel oositleri ortalayın ve konumlarını kaydedin. Görüntü alma yazılımında, XYZ tarama modunu seçin, görüntü formatını 256 x 256 piksel olarak ayarlayın, yakınlaştırma faktörünü 2,5x – 3,0x olarak ayarlayın ve 600 Hz’lik bir tarama frekansı seçin. Bu, yaklaşık 1,6 μs’lik bir piksel bekleme süresine karşılık gelir. Lazer gücünün yaklaşık% 10’unda (örnek düzeyde 4.0 μW’a karşılık gelir) 488 nm uyarma lazer çizgisi ayarlayın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve MTOC’lerden GFP sinyalini gözlemlemek için 500-550 nm’lik bir spektral bant genişliği kullanın. mCherry etiketli Cep192’den floresanın eşzamanlı gözlemi için, lazer gücünün yaklaşık% 8’inde (örnek seviyesinde 10.7 μW’ye karşılık gelir) 585 nm’lik bir uyarma lazer çizgisi ayarlayın ve 595-645 nm’lik spektral bant genişliğine ayarlanmış başka bir dedektör kullanın.NOT: Oosit sınırlarını eşzamanlı olarak tespit etmek için konfokal mikroskobun iletilen ışık dedektörünü (TLD) kullanmak yararlıdır. Canlı tarama modunu ve z-drive’ın manuel kontrolünü kullanarak, oositi MTOC’ler için tarayın. Bir mcMTOC algılandıktan sonra, etrafına kare bir ilgi alanı (ROI) çizin. 6. mcMTOC’lerin ablasyonu Bir femtosaniye lazeri 740 nm dalga boyuna ayarlayın.NOT: Lazer dalga boyu mikroskop ve lazer koşullarına göre değiştirilebilir. Lazer gücünü, numune düzleminde 60-70 mW güce karşılık gelen% 70-80’e ayarlamak için çoklu foton mikroskobunun elektro-optik modülatörünü kullanın ( Malzeme Tablosuna bakınız).NOT: Lazer bir femtosaniye darbe kompansatörü ile donatılmışsa, grup gecikme dağılımını (GDD) düzeltmek için kullanın. GDD düzeltmesi, verimli mcMTOC ablasyonu için gereken lazer gücü miktarını azaltır ve oositte fotohasarı en aza indirir. GDD kontrolü genellikle ticari çoklu foton mikroskoplarının görüntü yakalama yazılımı ile entegre edilir. Adım 5.6’dakiyle aynı görüntü formatını, yakınlaştırma faktörünü ve tarama sıklığını kullanın. Çizgi ve kare ortalaması parametrelerini 1 olarak ayarlayın. Seçilen ROI’nin tek bir lazer taramasını yaparak mcMTOC’nin ablasyonunu gerçekleştirmek için yazılımdaki Tara düğmesine tıklayın. Çoklu foton lazer pozlamasından önce ve sonra çekilen GFP etiketli yapıların görüntülerini karşılaştırarak ablasyonun sonuçlarını gözden geçirmek için adım 5.7’deki kanal ayarlarını kullanın. Ablasyon başarılı olursa, hedeflenen mcMTOC’deki GFP floresansının yoğunluğu arka planda gözlenen seviyelere düşer. GFP etiketleme yapısının bazı parçaları kalırsa, mcMTOC’nin çeşitli z düzlemlerine odaklanarak adım 6.4’ü bir veya daha fazla kez tekrarlayın. Ablasyon verimliliğini mcMTOC ile ilişkili mCherry sinyallerinin (mCh-Cep192) tamamen kaybolmasıyla doğrulamak için adım 5.7’deki kanal ayarlarını kullanın. Bir yumurtanın tüm MTOC’leri (çeşitli odak düzlemlerinde) ablatlanana kadar adım 5.8 ila adım 6.7’yi tekrarlayın.NOT: Bu protokol, çoklu foton lazer maruziyetini takiben mcMTOC tükenmesini doğrulamak ve GFP floresan kaybının GFP fotobeyazlatmadan kaynaklanma olasılığını dışlamak için bir strateji olarak mCh-Cep192 mikroenjeksiyonunu kullanır. Bununla birlikte, bu probun mikroenjeksiyonu isteğe bağlıdır ve ablasyon prosedürü için gerekli değildir.