Многофотонная лазерная абляция центров организации цитоплазматических микротрубочек в мышиных ооцитах

Все методы, описанные здесь, были одобрены Университетом Миссури (Animal Care Quality Assurance Ref. Number 9695). В настоящем исследовании использовались самки мышей cep192-eGFP в возрасте 6-8 недель. Для генерации мышей-репортеров Cep192-eGFP для интеграции гена-репортера EGFP в геном мыши CF-1 использовался CRISPR/Cas9-опосредованный гомологией репарация. Репортер EGFP был слит на C-конце Cep192 (неотъемлемый компонент MTOCs)15. Для поддержания мышиной колонии использовали гомозиготных мышей-репортеров Cep192-eGfp . Все животные содержались в клетках (до четырех животных / клетка) при 21 ° C и влажности 55%, с 12-часовым циклом света / темноты и доступом ad libitum к пище и воде. 1. Сбор ооцитов мыши Подготовьте культуральную среду (Chatot, Ziomek и Bavister, CZB19, см. Таблицу материалов) и инкубируйте ее при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи.ПРИМЕЧАНИЕ: Среда CZB может храниться при температуре 4 °C в течение 1 месяца (см. Дополнительный файл 1 для композиции носителя). Дополните среду CZB глютамином (1 мМ) и милриноном (2,5 мМ) (CZB + M) (см. Таблицу материалов) и поместите ее в инкубатор.ПРИМЕЧАНИЕ: Милринон является ингибитором фосфодиэстеразы, который поддерживает ооциты, арестованные при профазе I, и предотвращает мейотическое возобновление20. Подготовьте среду для сбора (минимальную необходимую среду без бикарбоната, MEM), содержащую 3 мг/мл поливинилпиролидона (PVP), 25 мМ HEPES (рН 7,3) (дополнительный файл 1) и милринона (2,5 мМ) (MEM/PVP +M, см. Таблицу материалов). Подготовьте коллекционную и культуральную посуду, сделайте четыре микрокапи (100 мкл) коллекционной среды (MEM/PVP+M) и две микрокапли (100 мкл) культуральной (CZB+M) среды в 60 мм и 35 мм чашки Петри соответственно и покройте их минеральным маслом (см. Таблицу материалов). Держите тарелку для сбора на слайде теплее и поставьте чашку культуры в инкубатор при 37 °C и 5% CO2. Вводят внутрибрюшинно 5 МЕ сывороточного гонадотропина беременной кобылы (ПМСГ, см. Таблицу материалов) половозрелым (6-8 недель) самкам мышей Cep192-eGFP за 44-48 ч до сбора ооцитов. Принесите мышей в жертву при вывихе шейки матки, определите и удалитеяичники 21 и перенесите их в часовой стакан, содержащий предварительно расплавленную среду сбора (MEM /PVP + M) при 37 °C. Зафиксируйте завязь, прикоснувшись шприцем объемом 1 мл к нижней части часового стекла и проколов его несколько раз (~ 40 раз на яичник), используя швейные иглы, связанные вместе, чтобы выпустить ооциты в среду. Используя пластиковую передаточную пипетку, перенесите всю среду, содержащую кучевые ооцитарные комплексы (КОК), со стадии 1.7 в пустую пластиковую чашку Петри толщиной 100 мм. Под стереомикроскопом соберите КОК с помощью стеклянной пипетки Пастера и перенесите их в коллекционную тарелку, содержащую MEM/PVP + M. Используя узкую стеклянную пипетку Пастера (диаметром около 100 мкм), механически обнажите ооциты путем мягкого повторяющегося пипетирования с последующим переносом и промывкой их в четырех микрокапсах (100 мкл) MEM / PVP + M (тарелка для сбора) перед их переносом в культурную чашку CZB + M. Инкубировать оголенные ооциты в течение 1 ч при 37 °C с 5% CO2 в воздухе. 2. Микроинъекция ооцитов Поместите каплю MEM/PVP +M объемом 250 мкл в пластиковую крышку чашки Петри диаметром 100 мм и накройте ее минеральным маслом.ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка чашки Петри имеет нижний ободок, который обеспечивает больше места для регулировки микроманипулятора. Включите систему микроинъекции (см. Таблицу материалов). Поместите микроинжекционное блюдо на стадию нагрева (37 °C) микроскопа. Загрузите инъекционную иглу 0,5 мкл кРНК mCh-Cep192с помощью наконечников пипетки микрозагрузчика (см. Таблицу материалов) и прикрепите инъекционную иглу к микроманипулятору. Переведите оголенные ооциты (стадия 1.11) в микрокапс объемом 250 мкл (стадия 2.1). Под объективом 20x или 40x отрегулируйте положение и фокус инъекции и удержания игл в соответствии с положением ооцитов (рисунок 1). Установите блок микроинъекции и установите давление впрыска (pi), давление компенсации (pc) и время инъекции (ti), чтобы иметь возможность вводить 5-10 пл цРНК mCh-Cep192 (для экзогенной маркировки MTOCs). Осторожно вводите ооциты, не касаясь ядра. После того, как все ооциты введены, промыть их тремя микрокапями CZB + M, перенести их в чашку для культивирования (CZB + M) и инкубировать их в течение 3 ч при 37 °C, чтобы обеспечить экспрессию mCh-Cep192. 3. Созревание ооцитов Подготовьте среду созревания, добавив глютамин (1 мМ) в среду CZB, предварительно уравновешенную в инкубаторе с 5% CO2 на воздухе при 37 °C в течение не менее 3 ч. Сделайте две микрокапли (100 мкл) среды созревания в чашке Петри 35 мм и накройте их минеральным маслом (чашка созревания). Промывайте профазные I-арестованные ооциты не менее трех раз в 100 мкл мильринонов-свободных микрокаппусках CZB, чтобы полностью удалить милринон и обеспечить мейотическое возобновление. Переведите ооциты в чашку созревания и инкубируйте их в течение 5 ч (прометафаза I стадия) в увлажненном инкубаторе с 5%СО2 на воздухе при 37 °С. 4. Подготовка ооцитов к абляции и визуализации Переложите прометафазу I ооцитов (стадия 3.4) в чашку для культивирования со стеклянным дном, содержащую 100 мкл среды созревания (стадия 3.1), покрытую минеральным маслом. 5. Подготовка микроскопа к абляции Не менее чем за 30 мин до абляции включите регулятор температуры для сценического инкубатора (см. Таблицу материалов) и установите его на 37 °C. Включите контроллер CO2 и установите его на 5% CO2. Выберите 40-кратный апохроматический объектив погружения масла и нанесите небольшую каплю погружного масла. Установите стеклянно-нижнюю чашку для культивирования с ооцитами на инкубатор и накройте инкубатор газовой крышкой. В программном обеспечении для получения изображений (см. Таблицу материалов) выберите опцию, позволяющую сохранять позиции нескольких этапов (например, «Определить метку и найти эксперимент»). Используя проходящую световую ярко-полевую подсветку, центрируются на отдельных ооцитах и сохраняют их положения. В программном обеспечении для получения изображений выберите режим сканирования XYZ , установите формат изображения на 256 x 256 пикселей, установите коэффициент масштабирования 2,5x – 3,0x и выберите частоту сканирования 600 Гц. Это соответствует времени выдержки пикселя приблизительно 1,6 мкс. Установите лазерную линию возбуждения 488 нм примерно на 10% мощности лазера (что соответствует 4,0 мкВт на уровне образца) (см. Таблицу материалов) и используйте спектральную полосу пропускания 500-550 нм для наблюдения сигнала GFP от MOC. Для одновременного наблюдения флуоресценции от метки mCherry Cep192 установите лазерную линию возбуждения 585 нм примерно на 8% мощности лазера (что соответствует 10,7 мкВт на уровне образца) и используйте другой детектор, установленный на спектральную полосу пропускания 595-645 нм.ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать детектор пропускаемого света (TLD) конфокального микроскопа для одновременного обнаружения границ ооцитов. Используя режим сканирования в реальном времени и ручное управление z-приводом, экранируйте ооцит на наличие MTOCs. Как только mcMTOC обнаружен, нарисуйте квадратную область интереса (ROI) вокруг него. 6. Абляция mcMTOCs Установите фемтосекундный лазер на длину волны 740 нм.ПРИМЕЧАНИЕ: Длина волны лазера может быть изменена в зависимости от микроскопа и условий лазера. Используйте электрооптический модулятор многофотонного микроскопа (см. Таблицу материалов) для установки мощности лазера на уровне 70%-80%, соответствующей мощности 60-70 мВт в плоскости образца.ПРИМЕЧАНИЕ: Если лазер оснащен фемтосекундным импульсным компенсатором, используйте его для коррекции дисперсии групповой задержки (GDD). Коррекция GDD уменьшает количество лазерной мощности, необходимой для эффективной абляции mcMTOC, и сводит к минимуму фотоповреждение яйцеклетки. Управление GDD обычно интегрировано с программным обеспечением для получения изображений коммерческих многофотонных микроскопов. Используйте тот же формат изображения, коэффициент масштабирования и частоту сканирования, что и на шаге 5.6. Задайте для параметров усреднения линии и кадра значение 1. Нажмите на кнопку Scan в программном обеспечении, чтобы выполнить абляцию mcMTOC путем проведения одного лазерного сканирования выбранной ROI. Используйте настройки канала из шага 5.7 для просмотра результатов абляции путем сравнения изображений структур, помеченных GFP, сделанных до и после многофотонной лазерной экспозиции. Если абляция проходит успешно, интенсивность флуоресценции GFP в целевом mcMTOC снижается до уровней, наблюдаемых в фоновом режиме. Если некоторые фрагменты GFP-маркировочной структуры остаются, повторите шаг 6.4 один или несколько раз, сосредоточившись на различных z-плоскостях mcMTOC. Используйте настройки канала из шага 5.7 для проверки эффективности абляции путем полной потери связанных с mcMTOC сигналов mCherry (mCh-Cep192). Повторяйте шаги с 5.8 по 6.7 до тех пор, пока все МТОК ооцита (в различных фокальных плоскостях) не будут абляции.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует микроинъекцию mCh-Cep192 в качестве стратегии для подтверждения истощения mcMTOC после воздействия многофотонного лазера и исключения возможности того, что потеря флуоресценции GFP вызвана фотоотбеливанием GFP. Однако микроинъекция этого зонда является необязательной и не требуется для процедуры абляции.