Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

Alle hier beschriebenen Methoden wurden von der University of Missouri genehmigt (Animal Care Quality Assurance Ref. Nummer 9695). Cep192-eGFP Reporter weibliche Mäuse im Alter von 6-8 Wochen wurden in der vorliegenden Studie verwendet. Um Cep192-eGFP-Reportermäuse zu erzeugen, wurde die CRISPR/Cas9-vermittelte homologiegesteuerte Reparatur verwendet, um das EGFP-Reportergen in das CF-1-Mausgenom zu integrieren. Der EGFP-Reporter wurde an der C-Endstation von Cep192 (einem integralen Bestandteil der MTOCs)15 fusioniert. Um die Mauskolonie zu erhalten, wurden homozygote Cep192-eGfp-Reportermäuse verwendet. Alle Tiere wurden in Käfigen (bis zu vier Tiere/Käfig) bei 21 °C und 55% Luftfeuchtigkeit gehalten, mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und Ad-libitum-Zugang zu Futter und Wasser. 1. Entnahme von Mauseizellen Das Kulturmedium (Chatot, Ziomek und Bavister, CZB19, siehe Materialtabelle) vorbereiten und über Nacht bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.HINWEIS: Das CZB-Medium kann 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden (siehe Zusatzdatei 1 für die Medienkomposition). Ergänzen Sie das CZB-Medium mit Glutamin (1 mM) und Milrinon (2,5 mM) (CZB + M) (siehe Materialtabelle) und legen Sie es in den Inkubator.HINWEIS: Milrinon ist ein Phosphodiesterase-Hemmer, der die in der Prophase I blockierten Eizellen aufrechterhält und die meiotische Wiederaufnahme verhindert20. Bereiten Sie das Sammelmedium (bikarbonatfreies minimales essentielles Medium, MEM) vor, das 3 mg/ml Polyvinylpyrolidon (PVP), 25 mM HEPES (pH 7,3) (Zusatzdossier 1) und Milrinon (2,5 mM) (MEM/PVP + M, siehe Materialtabelle) enthält. Bereiten Sie die Sammel- und Kulturschalen vor, stellen Sie vier Mikrotropfen (100 μL) Sammelmedium (MEM/PVP + M) und zwei Mikrotropfen (100 μL) Kulturmedium (CZB + M) in 60 mm bzw. 35 mm Petrischalen her und bedecken Sie sie mit Mineralöl (siehe Materialtabelle). Halten Sie die Auffangschale wärmer auf dem Objektträger und stellen Sie die Kulturschale bei 37 °C und 5% CO2 in den Inkubator. Injizieren Sie intraperitoneal 5 IE Serumgonadotropin (PMSG, siehe Materialtabelle) in geschlechtsreife (6-8 Wochen alte) Cep192-eGFP-Reporterinnen 44-48 h vor der Eizellentnahme. Opfern Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation, identifizieren und entfernen Sie die Eierstöcke21 und geben Sie sie in ein Uhrenglas mit vorgewärmtem Sammelmedium (MEM/PVP + M) bei 37 °C. Fixieren Sie den Eierstock, indem Sie eine 1-ml-Spritze am Boden des Uhrenglases berühren und mehrmals (~ 40 Mal pro Eierstock) mit zusammengebündelten Nähnadeln punktieren, um die Eizellen in das Medium freizusetzen. Mit einer Kunststoff-Transferpipette wird das gesamte Medium, das die Cumulus-Eizelle-Komplexe (KOK) enthält, aus Schritt 1.7 in eine leere 100-mm-Kunststoff-Petrischale überführt. Sammeln Sie die COCs unter einem Stereomikroskop mit einer Pasteur-Glaspipette und geben Sie sie in die Auffangschale, die MEM/PVP + M enthält. Mit einer schmalen Pasteur-Glaspipette (ca. 100 μm Durchmesser) werden die Eizellen mechanisch durch sanftes, wiederholtes Pipettieren entgiftet, anschließend in vier Mikrotropfen (100 μL) MEM/PVP + M (die Auffangschale) überführt und gewaschen, bevor sie in die Kulturschale CZB + M überführt werden. Die entblößten Eizellen für 1 h bei 37 °C mit 5% CO2 in der Luft bebrüten. 2. Mikroinjektion von Eizellen Geben Sie einen 250 μL Tropfen MEM/PVP + M in einen 100 mm Kunststoff-Petrischalendeckel und decken Sie ihn mit Mineralöl ab.HINWEIS: Der Petrischalendeckel hat einen unteren Rand, der mehr Platz für die Einstellung des Mikromanipulators bietet. Schalten Sie das Mikroinjektionssystem ein (siehe Materialtabelle). Stellen Sie die Mikroinjektionsschale auf den Wärmetisch (37 °C) des Mikroskops. Laden Sie die Injektionsnadel mit 0,5 μL mCh-Cep192cRNA unter Verwendung von Mikroladerpipettenspitzen (siehe Materialtabelle) und befestigen Sie die Injektionsnadel am Mikromanipulator. Übertragen Sie die entblößten Eizellen (Schritt 1.11) in den 250 μL Mikrotropfen (Schritt 2.1). Stellen Sie unter einem 20- oder 40-fachen Objektiv die Position und den Fokus der Injektions- und Haltenadeln entsprechend der Eizellposition ein (Abbildung 1). Richten Sie die Mikroinjektionseinheit ein und stellen Sie den Injektionsdruck (pi), den Kompensationsdruck (pc) und die Injektionszeit (ti) ein, um 5-10 pl mCh-Cep192 cRNA injizieren zu können (um die MTOCs exogen zu markieren). Injizieren Sie die Eizellen vorsichtig, ohne den Zellkern zu berühren. Sobald alle Eizellen injiziert sind, waschen Sie sie in drei Mikrotropfen CZB + M, geben Sie sie in die Kulturschale (CZB + M) und inkubieren Sie sie für 3 h bei 37 ° C, um die mCh-Cep192-Expression zu ermöglichen. 3. Eizellreifung Das Reifungsmedium wird durch Zugabe von Glutamin (1 mM) zu CZB-Medium vorbereitet, das in einem Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C für mindestens 3 h voräquilibriert wurde. Zwei Mikrotropfen (100 μL) des Reifungsmediums in einer 35 mm Petrischale herstellen und mit Mineralöl abdecken (Reifungsschale). Waschen Sie Prophase-I-blockierte Eizellen mindestens dreimal in 100 μL Milrinon-freien CZB-Mikrotropfen, um das Milrinon vollständig zu entfernen und eine meiotische Wiederaufnahme zu ermöglichen. Die Eizellen werden in die Reifungsschale überführt und für 5 h (Prometaphase-I-Stadium) in einem befeuchteten Inkubator mit 5%CO2 in Luft bei 37 °C inkubiert. 4. Eizellpräparat für Ablation und Bildgebung Die Prometaphase-I-Eizellen (Schritt 3.4) werden in eine Glasboden-Kulturschale mit 100 μL Reifungsmedium (Schritt 3.1) überführt, die mit Mineralöl bedeckt ist. 5. Mikroskopische Vorbereitung für die Ablation Schalten Sie mindestens 30 min vor dem Abtragen den Temperaturregler für den Stufeninkubator ein (siehe Materialtabelle) und stellen Sie ihn auf 37 °C ein. Schalten Sie den CO 2 -Regler ein und stellen Sie ihn auf 5% CO2 ein. Wählen Sie ein apochromatisches 40-faches Ölimmersionsobjektiv und tragen Sie einen kleinen Tropfen des Immersionsöls auf. Montieren Sie die Glasboden-Kulturschale mit den Eizellen auf einen Inkubator und decken Sie den Inkubator mit einem Gasdeckel ab. Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware (siehe Materialtabelle) eine Option aus, mit der Sie mehrere Stufenpositionen speichern können (z. B. “Markierung definieren und Experiment finden”). Zentrieren Sie mit Durchlicht-Hellfeldbeleuchtung die einzelnen Eizellen und speichern Sie deren Positionen. Wählen Sie in der Bilderfassungssoftware den XYZ-Scanmodus , stellen Sie das Bildformat auf 256 x 256 Pixel ein, stellen Sie den Zoomfaktor auf 2,5x – 3,0x ein und wählen Sie eine Scanfrequenz von 600 Hz. Dies entspricht einer Pixelverweilzeit von ca. 1,6 μs. Stellen Sie eine 488-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 10% der Laserleistung ein (was 4,0 μW auf Probenebene entspricht) (siehe Materialtabelle) und verwenden Sie eine spektrale Bandbreite von 500-550 nm, um das GFP-Signal der MTOCs zu beobachten. Für die gleichzeitige Beobachtung der Fluoreszenz aus dem mCherry-markierten Cep192 stellen Sie eine 585-nm-Anregungslaserlinie auf etwa 8% der Laserleistung ein (was 10,7 μW auf Probenebene entspricht) und verwenden Sie einen anderen Detektor, der auf eine spektrale Bandbreite von 595-645 nm eingestellt ist.HINWEIS: Es ist hilfreich, den Durchlichtdetektor (TLD) des konfokalen Mikroskops zu verwenden, um Eizellgrenzen gleichzeitig zu erkennen. Verwenden Sie einen Live-Scan-Modus und die manuelle Steuerung des Z-Laufwerks, um die Eizelle auf MTOCs zu untersuchen. Sobald ein mcMTOC erkannt wurde, zeichnen Sie eine quadratische Region of Interest (ROI) um ihn herum. 6. Ablation von mcMTOCs Stellen Sie einen Femtosekundenlaser auf eine Wellenlänge von 740 nm ein.HINWEIS: Die Laserwellenlänge kann je nach Mikroskop und Laserbedingungen geändert werden. Verwenden Sie den elektrooptischen Modulator des Multiphotonenmikroskops (siehe Materialtabelle), um die Laserleistung auf 70%-80% einzustellen, was 60-70 mW Leistung auf der Probenebene entspricht.HINWEIS: Wenn der Laser mit einem Femtosekunden-Pulskompensator ausgestattet ist, verwenden Sie diesen, um die Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) zu korrigieren. Die GDD-Korrektur reduziert die Menge an Laserleistung, die für eine effiziente mcMTOC-Ablation erforderlich ist, und minimiert Lichtschäden an der Eizelle. Die GDD-Steuerung ist in der Regel in die Bildaufnahmesoftware kommerzieller Multiphotonenmikroskope integriert. Verwenden Sie dasselbe Bildformat, denselben Zoomfaktor und dieselbe Scanfrequenz wie in Schritt 5.6. Legen Sie die Parameter für die Mittelung von Linie und Rahmen auf 1 fest. Klicken Sie auf die Schaltfläche Scan in der Software, um die Ablation des mcMTOC durchzuführen, indem Sie einen einzigen Laserscan des ausgewählten ROI durchführen. Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ergebnisse der Ablation zu überprüfen, indem Sie die Bilder der GFP-markierten Strukturen vergleichen, die vor und nach der Multiphotonen-Laserbelichtung aufgenommen wurden. Wenn die Ablation erfolgreich ist, sinkt die Intensität der GFP-Fluoreszenz im angestrebten mcMTOC auf die im Hintergrund beobachteten Werte. Wenn einige Fragmente einer GFP-Markierungsstruktur verbleiben, wiederholen Sie Schritt 6.4 ein- oder mehrmals, indem Sie sich auf verschiedene z-Ebenen des mcMTOC konzentrieren. Verwenden Sie die Kanaleinstellungen aus Schritt 5.7, um die Ablationseffizienz durch den vollständigen Verlust von mcMTOC-assoziierten mCherry-Signalen zu überprüfen (mCh-Cep192). Wiederholen Sie Schritt 5.8 bis Schritt 6.7, bis alle MTOCs einer Eizelle (auf verschiedenen Fokusebenen) abgetragen sind.HINWEIS: Dieses Protokoll verwendet die mCh-Cep192-Mikroinjektion als Strategie, um die mcMTOC-Depletion nach Multiphotonen-Laserbelichtung zu bestätigen und die Möglichkeit auszuschließen, dass der Verlust der GFP-Fluoreszenz durch GFP-Photobleiche verursacht wird. Die Mikroinjektion dieser Sonde ist jedoch optional und für den Ablationsvorgang nicht erforderlich.