כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.
השבתת גנים חיונית לחקר תפקוד הגנים ומייצגת אסטרטגיה מבטיחה לטיפול במגוון רחב של מחלות. בין הטכנולוגיות המסורתיות, הפרעות RNA סובלות מביטול מטרה חלקי ומהצורך בטיפולים לכל החיים. לעומת זאת, נוקלאזות מלאכותיות יכולות לכפות השתקה גנטית יציבה באמצעות השראת שבר גדיל כפול של DNA (DSB), אך מחקרים אחרונים מטילים ספק בבטיחות של גישה זו. עריכה אפיגנטית ממוקדת באמצעות מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עשויה להוות פתרון, שכן מתן יחיד של שילובי ETR ספציפיים יכול להוביל להשתקה מתמשכת מבלי לגרום לשברי DNA.
ETRs הם חלבונים המכילים תחום קושר DNA ניתן לתכנות (DBD) ומשפיעים ממדכאי שעתוק טבעיים. באופן ספציפי, שילוב של שלושה ETR המצוידים בתחום KRAB של ZNF10 אנושי, התחום הקטליטי של DNMT3A אנושי ו- DNMT3L אנושי, הוכח כגורם למצבים אפיגנטיים דכאניים תורשתיים על גן היעד ETR. אופי הפגע וברח של פלטפורמה זו, היעדר ההשפעה על רצף הדנ”א של המטרה, והאפשרות לחזור למצב הדיכוי על ידי דה-מתילציה של דנ”א לפי דרישה, הופכים את ההשתקה האפיגנטית לכלי משנה משחק. שלב קריטי הוא זיהוי המיקום הנכון של תעודות סל על גן המטרה כדי למקסם את המטרה ולמזער השתקה מחוץ למטרה. ביצוע שלב זה במסגרת הפרה-קלינית האחרונה ex vivo או in vivo יכול להיות מסורבל.
מאמר זה לוקח את מערכת הקריספר/Cas9 המתה קטליטית כ-DBD פרדיגמטי עבור ETRs, ומתאר פרוטוקול המורכב ממסך במבחנה של רנ”א מנחה (gRNAs) המשולב בשילוב ETR משולש להשתקה יעילה על המטרה, ולאחר מכן הערכה של פרופיל הספציפיות הרחב של הגנום של פגיעות מובילות. זה מאפשר לצמצם את הרפרטואר הראשוני של gRNA מועמדים לרשימה קצרה של מבטיחים, שמורכבותם מתאימה להערכתם הסופית במסגרת העניין הרלוונטית מבחינה טיפולית.
השבתת גנים שיחקה באופן מסורתי תפקיד מפתח בחקר תפקוד גנים הן במודלים תאיים והן במודלים של בעלי חיים. יתר על כן, בשני העשורים האחרונים, עם עליית הריפוי הגנטי, הוצע כגישה בעלת פוטנציאל לשנות את כללי המשחק לטיפול במחלות הנגרמות על ידי מוטציות רווח של תפקוד1, מחלות זיהומיות2, או פתולוגיות שבהן השתקה של גן אחד עשויה לפצות על פגם תורשתי בגן אחר3. לבסוף, הוצע השבתה גנטית של רגולטורים מרכזיים של כושר תאי ובקרה תפקודית כדי לשפר את היעילות של מוצרי תאים עבור אימונותרפיה לסרטן4 ורפואה רגנרטיבית5.
בין הטכנולוגיות השונות להשגת השבתת גנים, אחת המבטיחות ביותר היא השתקה אפיגנטית ממוקדת 6,7. בליבה של טכנולוגיה זו נמצאים מה שמכונה מדכאי שעתוק מהונדסים (ETRs), חלבונים כימריים המורכבים מתחום קושר DNA ניתן לתכנות (DBD) ותחום אפקט (ED) עם פונקציית דיכוי אפיגנטית. חלבוני אצבע אבץ (ZFPs)8, אפקטיבים דמויי מפעילי שעתוק (TALEs)9, או DBDs מבוססי CRISPR/dCas910 יכולים להיות מתוכננים כך שיקשרו באופן סלקטיבי את ה-ED לרצף המקדם/משפר של גן המטרה שיושתק. ברגע שהוא שם, ה-ED של ה-ETR מבצע את פעילות ההשתקה שלו על ידי הטלת סימנים אפיגנטיים דכאניים הגורמים להטרוכרומטין, כגון שינויים בהיסטון (H3K9 11,12 או H3K27 13 מתילציה, H3 או H4 deacetylation 14) ומתילציה של CpG DNA 15, בהתאם לתחום הדיכוי שבו נעשה שימוש.
בפרט, בהשראת התהליכים המולקולריים של דיכוי שעתוק קבוע של רטרו-וירוסים אנדוגניים המתרחשים בעובר16 לפני ההשרשה, נוצר שילוב של שלושה ETR כדי לנצל את ה- EDs הבאים: i) תחום התיבה המשויכת לקרופל (KRAB) של ZNF10 אנושי; ii) התחום הקטליטי של DNA de novo אנושי methyltransferase 3A (DNMT3A); ו-iii) DNA אנושי באורך מלא דמוי מתילטרנספראז 3 (DNMT3L). KRAB הוא תחום דיכוי שמור המשותף למספר ZFPs בבעלי חוליות גבוהים17,18, שפעילות ההשתקה שלו מבוססת בעיקר על יכולתו לגייס KAP1 19 – חלבון פיגום המקיים אינטראקציה עם מספר השראות הטרוכרומטין אחרות20 – הכוללות את קומפלקס השיפוץ והדה-אצטילציה של הנוקלאוזומים (NuRD) 21, ההיסטון מתילטרנספראז H3K9 SETDB122, וקורא המתילציה H3K9 HP1 23, 24, בין היתר.
DNMT3A מעביר באופן פעיל קבוצות מתיל על הדנ”א ברצפי CpG25. הפעילות הקטליטית של DNMT3A משופרת על ידי הקשר הפיזיקלי שלו עם DNMT3L, פרלוג מוגבל עובריים ותאי נבט של DNMT3A חסר את התחום הקטליטי האחראי על העברת קבוצת מתיל26,27. מתילציה של דנ”א באזורים עשירים ב-CpG – המכונים איי CpG (CGIs) – המשובצת באלמנטים המקדמים/משפרים של גנים של יונקים קשורה בדרך כלל להשתקת שעתוק28. חשוב לציין, לאחר ההפקדה, מתילציה של CpG יכולה לעבור בתורשה יציבה לאורך מיטוזה על ידי קומפלקס מולקולרי מבוסס UHRF1-DNMT129.
ביטוי יתר יציב של ETR בתא המטרה יכול להיות בעייתי, ככל הנראה בגלל הסיכונים הגוברים של פעילות מחוץ למטרה ודיכוי של אינטראקטורים אנדוגניים מאתרי המטרה הפיזיולוגיים שלהם לאורך זמן. עם זאת, ביטוי חולף של moieties ETR יחיד יכול להיכשל לגרום להשתקה לטווח ארוך עם יעילות גבוהה30, מה שפוגע ביישום הטיפולי שלהם. לכן, פריצת דרך משמעותית בתחום הייתה הראיות לכך שהשילוב של שלושת ה-ETR מבוססי KRAB, DNMT3A ו-DNMT3L יכול ליצור סינרגיה, ואפילו כאשר הם מועברים רק באופן זמני, לכפות על רצף המקדם של גן המטרה מתילציה H3K9 ו-CpG. אלה נקראים ומופצים על ידי התא לאורך מיטוזה, מה שמוביל להשתקה תורשתית במספר שורות תאים אנושיים ומורין, כמו גם תאים ראשוניים בתרבית ex vivo 30.
יש לציין כי ניתן להחזיר את ההשתקה האפיגנטית שנכפתה על ידי תעודות הסל לפי דרישה על ידי גיוס ממוקד (למשל, גיוס של דמתילאז DNA TET1 מבוסס CRISPR/dCas9 על הלוקוס המושתק) או פרמקולוגית (מתן מעכב DNA methyltransferase 5-Aza) דהמתילציה30 של DNA, תרופה פוטנציאלית במקרה של תופעות לוואי הקשורות ל-ETR. תוארו גם תעודות סל All-in-One הנושאות את שלושת ה-EDs מבוססי KRAB, DNMT3A ו-DNMT3L, והראו יעילות השתקה משמעותית בקווי תאים31,32 כנגד הרוב הגדול של גנים מקודדי חלבונים. יתר על כן, מספר מחקרים שהשתמשו ב-ETR דיווחו על פרופיל בטיחות גבוה, ללא פעילות משמעותית מחוץ למטרה במונחים של מתילציה דה נובו CpG או שינוי בנגישות הכרומטין30,31,32. עם זאת, ניתוח ייעודי של פרופיל הספציפיות של ETR המצויד ב- DBD שעוצב לאחרונה מומלץ לפני יישומים קליניים.
מנקודת מבט קלינית, השתקה אפיגנטית ממוקדת עשויה לספק יתרונות קריטיים הן להפרעות RNA (RNAi) מבוססות Knockdown33 והן לשיבוש גנים מלאכותי מבוסס Nuclease8. בניגוד ל-RNAi, השתקה אפיגנטית ממוקדת עשויה לגרום לביטול מלא של המטרה בכל תא ואינה דורשת טיפול תקופתי כדי להבטיח השתקה ארוכת טווח; בניגוד לשיבוש גנטי, הוא משאיר את רצף הדנ”א ללא שינוי, ונמנע מיצירת שברים דו-גדיליים של דנ”א (DSB). DSBs יכולים לגרום לאפופטוזיס ולמעצר מחזור התא, מה שעלול להוביל לברירה נגד תאים עם מסלול p53 פונקציונלי 34,35, ובמיוחד בהגדרות עריכת גנים מרובי רקעים, סידור מחדש של כרומוזומלים35. יתר על כן, על ידי העברת תוצאת הפסיפס הבלתי הפיכה של תיקון DSB36 של DNA שאינו הומולוגי-מצטרף-קצה, שיבוש גנים אינו יכול למנוע תיקון בתוך מסגרת של המטרה לרצפי קידוד פונקציונליים כאחת התוצאות הסופיות, ובניגוד להשתקה אפיגנטית, לא ניתן למחוק אותה לפי דרישה.
לבסוף, השתקה אפיגנטית טומנת בחובה פוטנציאל להרחיב את טווח האלמנטים הגנטיים הניתנים למטרה למחלקות העמידות באופן מלא או לפחות חלקי ל-RNAi ולשיבוש גנים, כגון אלמנטים רגולטוריים שאינם משועתקים ו-RNA30,32 שאינם מקודדים. הצעד הקריטי הראשון עבור כל יישום השתקה אפיגנטית ממוקדת הוא לתכנן פאנל של ETR המכסה את הרצפים הרגולטוריים השונים של גן המטרה ולזהות את אלה בעלי הביצועים הטובים ביותר. מספר ה-ETR שייבדקו יכול להיות קריטי, בהתחשב בחלק ההולך וגדל של הגנום שיכול להיות ממוקד על ידי טכנולוגיות קישור DNA ניתנות לתכנות שנמצאות כל הזמן בפיתוח37. ביצוע המסך של ETR ישירות על סוג התא שבו להשתיק טיפולית את גן המטרה יהיה האפשרות הרלוונטית ביותר. עם זאת, מסכים בעלי תפוקה גבוהה יכולים להיות מסורבלים מבחינה טכנית בתאים ראשוניים בשל הישרדותם המוגבלת בתרבית ויכולתם ההנדסית הלא אופטימלית לעתים קרובות. מסכים בקנה מידה גדול יכולים להיות אפילו יותר בלתי אפשריים in vivo.
חלופה מעשית יותר כוללת ביצוע סינון ראשוני של פאנל גדול של ETR בקווי תאים הניתנים להנדסה בקלות בהתחלה, ולאחר מכן רק אימות המבטיחים ביותר בסוג התא הרלוונטי מבחינה טיפולית. סוגיה מקבילה היא בחירת קריאה מתאימה למדידת יעילות ההשתקה של תעודות הסל. הערכה ישירה של רמות השעתוק או החלבון של גן המטרה על ידי RT-qPCR, Western Blot או ELISA יכולה להיות יקרה וגוזלת זמן ועשויה להיות חסרת רגישות מספקת, ובכך להגביל את היישום שלהם בסקאלות תפוקה גבוהות. יצירת קווי תאי כתב מהונדסים אד-הוק , שבהם פלואורופור ממוקם תחת בקרת שעתוק של רצפי הבקרה של גן המטרה, מאפשרת ניצול של הגישה מבוססת ציטומטריית זרימה לקריאת השתקה אפיגנטית ברמת התא הבודד ובקצב תפוקה גבוה.
בעקבות שיקולים כלליים אלה, מאמר זה מתאר פרוטוקול המורכב ממסך במבחנה של ETR ליעילות השתקה על המטרה, ואחריו הערכה של הפעילות מחוץ למטרה ברחבי הגנום של הפגיעות המובילות. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם את הרפרטואר הראשוני של ETR מועמדים לרשימה קצרה של מבטיחים, שמורכבותם מתאימה להערכתם הסופית בסוג התא הרלוונטי מבחינה טיפולית.
בין ה-DBD השונים הניתנים לתכנות שניתן לנצל ליצירת ETRs, פרוטוקול זה יתמקד בטכנולוגיה מבוססת CRISPR/dCas9, בגלל הקלות של תכנון gRNA המשתרע על פני מקדם גן המטרה בקנה מידה של תפוקה גבוהה. עם זאת, ניתן לאמץ את אותה זרימת עבודה קונספטואלית המתוארת להלן כדי להעריך את היעילות והספציפיות של ETR המצוידים ב- DBD אחרים.
השתקה אפיגנטית ממוקדת עשויה להוות פתרון מבטיח לטיפול בהפרעות שיכולות להפיק תועלת מהשבתה קבועה של גנים, כולל מחלות הנגרמות על ידי מוטציות רווח של תפקוד1, מחלות זיהומיות2, ופתולוגיות שבהן השתקה של גן אחד עשויה לפצות על פגם תורשתי בגן אחר3 או לשחרר את מלוא הפוטנציאל של טיפולים תאיים מאמצים4, 5. על ידי פעולה ברמת הכרומטין והתפשטות אוטומטית על ידי התא 7,30,32, השתקה אפיגנטית יכולה למנוע שינויים רעילים (למשל, סידור מחדש כרומוזומלי) של רצף הדנ”א של גן המטרה והשתקה חלקית וחולפת של המטרה, שהם מגבלות של שיבוש גנטי מלאכותי מבוסס נוקלאז8,34,35 ו knockdown 33 מבוסס RNAi, בהתאמה.
אחד הצעדים המקדימים המרכזיים בכל פרוטוקול השתקה אפיגנטית הוא לזהות את המיקום הנכון על גן המטרה כדי לכוון את ETRs שיפקידו את הסימנים האפיגנטיים המדכאים הדרושים כדי לכבות את פעילות השעתוק של המטרה. אלמנטים רגולטוריים שונים של התחלת שעתוק – פרוקסימליים ודיסטליים עשויים להסכים לתמוך בפלט השעתוק של גן אנושי נתון54. יתר על כן, ניתן לזהות כעת אתרי יעד שונים לכל אלמנט רגולטורי ספציפי הודות למספר ההולך וגדל של טכנולוגיות קישור DNA הניתנות לתכנות6. לכן, פרוטוקולים, כמו זה המתואר כאן בקווי תאים מהונדסים, יכולים לשמש למינוי אתרי מטרה בודדים ו / או אזורים גנומיים המקובלים להשתקה אפיגנטית בתיווך ETR, לפני תחילת מאמצי הערכה מסורבלים וגוזלי זמן של המועמדים הטובים ביותר במסגרת הטיפולית הסופית. כמה היבטים קריטיים של הפרוטוקול מתוארים בהמשך.
הנדסה של קו תא כתב המנבא את המטרה הטיפולית הסופית
למרות האופטימיזציה המתמדת של פרוטוקולי הנדסת התא – הנדרשים כאן כדי להכניס את קידוד הקלטות עבור המדווח הפלואורסצנטי בגן המטרה ולהעביר את ה- ETR – זה לא מובן מאליו שהם עשויים להיות זמינים כבר עבור קו התא הדומה ביותר למטרה הטיפולית הסופית. במקרה זה, ניתן ליישם אסטרטגיות הפחתה שונות: א) ניצול ערכות אופטימיזציה המסופקות על ידי ספקים כדי לייעל בבית את פרוטוקול הטרנספקציה עבור קו תאי היעד; ב) מעבר לקווי תאים אחרים שעדיין מבטאים את גן המטרה אך שייכים לרקמות שאינן המטרה הטיפולית הסופית – שעבורן פרוטוקולים הנדסיים עברו אופטימיזציה נרחבת. במקרה שאפשרויות אלה אינן זמינות, ניתן לשקול מעבר לסוגי תאים ראשוניים או אורגנואידים המייצגים את המטרה הסופית. כשיקול כללי הן למחקרים פרה-קליניים והן ליישומים טיפוליים של השתקה אפיגנטית מבוססת ETR, יש להיפטר מתרחישים שבהם גן המטרה חיוני לסוג תא היעד. השתקה מלאה וארוכת טווח של גן חיוני המוטל על ידי תעודות הסל תוביל לברירה נגדית של תאי המטרה לאורך זמן (ופוטנציאלית, לרעילות הטיפול). טכנולוגיות חלופיות המספקות ביטול מטרה חלקי, כגון RNAi33, עדיפות במקרים אלה.
הערכת פעילות ההשתקה הממוקדת של תעודות הסל
ETRs המבוססים על שילוב של KRAB, DNMT3A ו- DNMT3L הוכיחו את עצמם כיעילים נגד הרוב הגדול של גנים מקודדי חלבונים, עם חלון מיקוד מתירני ארוך של כ -1 קילו במרכזו אתר התחלת השעתוק32. כדי לקבל מושג כיצד נראה ניסוי השתקה אפיגנטי מבוצע היטב, הפרטים הטכניים והתוצאות של השתקת הגן B2M בתאי K-562 מסופקים כאן. זה יכול להיחשב בקרה חיובית חשובה להיכלל לא רק על ידי חוקרים העובדים עם תאי K-562, אלא גם על ידי אלה המתקרבים לטכנולוגיה מבוססת ETR בפעם הראשונה. כפי שצוין בפרוטוקול, שיבוש גנים מבוסס נוקלאז מלאכותי (למשל, CRISPR/Cas9) מומלץ כבקרה נוספת הן על יעילות העברת הגנים בסוג התא המעניין והן על הפנוטיפ של תאים משוללי גן המטרה. לאחר המסך הראשוני של gRNA להיות משולב עם ETR מבוסס CRISPR/dCas9, אם אף אחד gRNA נבדק אינו מסוגל להשתיק לצמיתות את גן המטרה, יש לשקול, בסדר הבא: 1) להגדיל את כמות gRNA ו ETR נמסר; 2) בדיקת מאגרים של ה-gRNA המובילים בחיפוש אחר השפעות סינרגטיות ביניהם. אם עדיין לא הושגה השתקה ארוכת טווח, יש לשקול: 3) בדיקת gRNA נוספים, שעשויים להתמקד באתרים רלוונטיים יותר להורות על השתקה אפיגנטית; 4) מעבר לפלטפורמות DBD מבוססות ZFP8 או TALE9, אשר עשויות להיות בעלות יכולת קשירה משופרת לכרומטין-המטרה; 5) מעבר מארעי ליציב – לדוגמה, שילוב ביטוי וקטורי נגיפי של ETR (מבני ההיתוך gRNA או dCas9 או שניהם בעת אימוץ טכנולוגיית CRISPR/dCas9). מכיוון שהקבוצה שלנו פיתחה, ויש לנו ניסיון רב עם, המסירה המשותפת של שלושת ETR30 הנפרדים, הפרוטוקול והתוצאות המוצגים כאן מבוססים על גישה זו. עם זאת, זרימת עבודה קונספטואלית דומה עשויה להיות מיושמת עבור מערכת All-in-One מבוססת CRISPR32.
הערכת הפעילות מחוץ למטרה של תעודות הסל
מחקרים רבים הראו אינדיקציות ראשוניות במבחנה של הספציפיות של ETR בהתבסס על השילוב של KRAB, DNMT3A ו- DNMT3L תחומי אפקט30,31,32. עם זאת, אם מבין ה-gRNA שנבדקו, אף אחד מהם לא מראה פרופיל ספציפיות משביע רצון במונחים של ויסות שעתוק ו/או מתילציה של דנ”א דה נובו, ניתן לנקוט בשתי אסטרטגיות שאינן סותרות זו את זו: א) הפחתת זמן השהייה של ה-ETR בתוך התא (וכתוצאה מכך הפעילות הפוטנציאלית שלהם מחוץ למטרה) על ידי הפחתת המינונים של ETR או בדיקת מערכות אספקה חלופיות. לדוגמה, בהשוואה לפלסמידים, הן mRNA והן אספקת חלבונים צפויים להפחית את זמן החשיפה התאית ל-ETRs, וכתוצאה מכך, את הסבירות לפעילות מחוץ למטרה55; ב) מעבר לגרסאות Cas9 עדכניות יותר, המותאמות להפחתת הקישור מחוץ למטרה של פלטפורמת56, או לטכנולוגיות קשירת DNA חלופיות מבוססות ZFP8 או TALE9. חשוב לקחת בחשבון כי בהשוואה לדגימות שטופלו במדומה, הפעילות על המטרה ומחוץ למטרה של השתקת גנים מושפעות לא רק מהקישור של DBD לרצף המטרה שלהם, אלא גם מהיכולת הפוטנציאלית של תחומי ההשפעה האפיגנטית להיות מגויסים לאתרים אחרים על ידי הגורמים המשותפים הטבעיים והאנדוגניים שלהם. לכן, קיצור זמן השהייה של ה-ETR בתא היעד עשוי להקטין לא רק את הסבירות לקשירת ה-DBD לאתרים מחוץ ליעד, אלא גם את הסבירות של ה-ETR לקיים אינטראקציה עם גורמים משלימים אנדוגניים, עם יתרונות פוטנציאליים במונחים של ספציפיות וחסרונות במונחים של פעילות על המטרה. לבסוף, בהשוואה לדגימות שטופלו בדמה, חלק משינויי המתילציה של CpG השעתוק והפחות סבירים שנמדדו בתאים מושתקים יכולים פשוט להיגזר על ידי שלילת גן המטרה. אלה אינם נחשבים מחוץ למטרות של טכנולוגיית ההשתקה. כדי לזהות אותם, יש לכלול גם שיבוש גנים על ידי נוקלאז מלאכותי בלוח הניסוי 8,9,10. שינויים ביולוגיים עקב אובדן תפקודי של גן המטרה יתחלקו בין השתקה אפיגנטית לבין טכנולוגיה חלופית זו.
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להודות לאנג’לו אמבילה, פאולה קאפאסו, אילריה קסרטה, טניה באצ’גה, אליס רשיניה, ולריה מוליקה ודבורה צ’יפריה על המאמץ המשותף בפיתוח טכנולוגיית ההשתקה האפיגנטית לאורך השנים; דז’אן לזרביץ’ ופרנצ’סקה ג’יאנזה לסקירה ביקורתית של ניתוחי RNA-seq ו-MeDIP-seq המתוארים בפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל- A.L. מקרן Telethon (מענק TIGET מס ‘F1) ותוכנית Horizon 2020 של האיחוד האירופי (UPGRADE). האיורים נוצרו עם BioRender.com.
תרומת המחברים
A.M, M.A.C., F.G. ו-A.C. תרמו לעיצוב הפרוטוקול ולכתיבת כתב היד; S.V., I.M. ו-D.C. עיצבו את מדורי הביואינפורמטיקה של הפרוטוקול ותיקנו את כתב היד; א.מ. וא.ל. עיצבו את הפרוטוקול, הגו וכתבו את כתב היד עם קלט מכל המחברים.
4200 TapeStation System | Agilent | G2991BA | DNA quantification |
4D-Nucleofector X Unit | Lonza Bioscience | AAF-1003X | Nucleofection |
B2M silencing gRNA #1 | Lombardo's lab | GCAATCAGGACAAGGCCCGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #2 | Lombardo's lab | GGGGTAGGAGAGACTCACGC | Gene silencing |
B2M silencing gRNA #3 | Lombardo's lab | GAGTCCAGGGCTGGATCTCG | Gene silencing |
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer | BD Biosciences | https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion | Fluorescence Activated Cell Sorting |
bedtools | Bedtools | http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ | Processing of genomic intervals |
bwa | Ih3 | https://github.com/lh3/bwa | Alignment of MeDIP-seq reads |
Chopchop | Valen's lab | http://chopchop.cbu.uib.no/ | gRNA selection software |
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine | Corning | 10-040-CV | Cell culture |
cqn | Bioconductor | http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html | Region-wise normalization by GC-content |
CRISPR design suite | Zhang's lab | https://zlab.bio/resources-2 | off-target gRNA binding prediction |
CRISPRoff-v2.1 plasmid | Addgene | 167981 | Gene silencing |
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer | Beckman Coulter | C01161 | Flow cytometry |
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab |
ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt |
Genetic engineering |
E220 Focused-ultrasonicator | Covaris | 500239 | DNA sonication |
edgeR | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html | Differential abundance testing |
EnGen Mutation Detection Kit | NEB | E3321 | Gene disruption quantification |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | Cell culture |
Flowjo | BD Biosciences | https://www.flowjo.com/solutions/flowjo | Flow cytometry data analysis software |
Gel Loading Dye, Purple (6x) | NEB | B7024S | DNA gel loading |
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase | Promega | M7401 | PCR amplification |
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AGGCTACTAGCCCCATCAAG | Genetic engineering |
hCas9 plasmid | Addgene | 41815 | Genetic engineering |
High Sensitivity D1000 Reagents | Agilent | 5067-5585 | DNA quantification |
High Sensitivity D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5584 | DNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | RNA quantification |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | RNA quantification |
IPure kit | Diagenode | C03010011 | Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product |
K-562 cells | ATCC | CCL-243 | Cell engineering |
KAPA Library Quantification Kit | Roche | KK4824 | MeDIP-Seq libraries preparation |
MACS2 | Taoliu | https://github.com/macs3-project/MACS | Identification of methyl-enriched regions |
MagMeDIP kit | Diagenode | C02010020 | 5-methylcytosine immunoprecipitation |
NextFlex Methylseq kit 1 | Bioo Scientific | 5118-01 | MeDIP-Seq libraries preparation |
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 | Illumina | SY-415-1002 / 20012850 | Next Generation Sequencing |
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA | Macherey-nagel | 740410.50 | Midiprep plasmid preparation |
One Shot TOP10 Chemically Competent cells | ThermoFisher | C404010 | Plasmid transformation |
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid | Addgene | 48240 | Gene activation |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid | Lombardo's lab | available on request (lombardo.angelo@hsr.it) | Gene silencing |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | Cell culture |
phU6.sgRNA plasmid | Addgene | 53188 | Genetic engineering |
PowerPac Basic Power Supply | Biorad | 1645050 | Agarose gel electrophoresis |
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | GTATTTGCTGGTTATGTTAG | Genetic engineering |
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene | Lombardo's lab | AATGGTTGAGTTGGAC | Genetic engineering |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | DNA extraction |
Qubit | Thermo Fisher | Q33238 | DNA quantification |
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | DNA quantification |
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit | Thermo Fisher | Q32852 | RNA quantification |
Restriction enzymes | NEB | DNA digestion | |
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction |
Rsubread | Bioconductor | https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html | Quantification of gene expression |
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) | Lonza Bioscience | V4XC-2032 | Nucleofection |
SnapGene | Dotmatics | https://www.snapgene.com/ | Molecular biology design software |
STAR | Alexander Dobin | https://github.com/alexdobin/STAR | Alignment of RNA-seq reads |
T100 Thermal Cycler | Biorad | 1861096 | PCR amplification |
T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | DNA ligation |
TAE Buffer | Fisher scientific | BP1332500 | Agarose gel electrophoresis |
TruSeq Stranded Total RNA kit | Illumina | 20020597 | RNA-Seq library preparation |
UltraPure Agarose | ThermoFisher | 16500500 | Agarose gel |