JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

In Vitro Hedeflenen Epigenetik Susturma için Tasarlanmış Transkripsiyonel Baskılayıcıların Seçimi

Published: May 05, 2023
doi:
10.3791/64403
, , , , , , ,
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget),IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences,IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies,National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Burada, yüksek, uzun vadeli, kararlı, hedefe yönelik susturma verimliliğine ve düşük genom çapında, hedef dışı aktiviteye sahip tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcıların (ETR’ler) in vitro seçimi için bir protokol sunuyoruz. Bu iş akışı, aday ETR’lerin başlangıçtaki karmaşık repertuarını, terapötik olarak ilgili ortamlarda daha fazla değerlendirme için uygun olan kısa bir listeye indirgemeye olanak tanır.

Abstract

Gen inaktivasyonu, gen fonksiyonunu incelemek için etkilidir ve çok çeşitli hastalıkların tedavisi için umut verici bir stratejiyi temsil eder. Geleneksel teknolojiler arasında, RNA interferansı, kısmi hedef iptali ve ömür boyu tedavi gerekliliğinden muzdariptir. Buna karşılık, yapay nükleazlar, bir DNA çift iplikçik kırılmasının (DSB) indüksiyonu yoluyla kararlı gen inaktivasyonunu empoze edebilir, ancak son çalışmalar bu yaklaşımın güvenliğini sorgulamaktadır. Tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcılar (ETR’ler) aracılığıyla hedeflenen epigenetik düzenleme bir çözümü temsil edebilir, çünkü spesifik ETR kombinasyonlarının tek bir uygulaması, DNA kırılmalarına neden olmadan kalıcı susturmaya yol açabilir.

ETR’ler, programlanabilir bir DNA bağlama alanı (DBD) ve doğal olarak oluşan transkripsiyonel baskılayıcılardan efektörler içeren proteinlerdir. Spesifik olarak, insan ZNF10’un KRAB alanı, insan DNMT3A ve insan DNMT3L’nin katalitik alanı ile donatılmış üç ETR’nin bir kombinasyonunun, ETR hedef geni üzerinde kalıtsal baskılayıcı epigenetik durumları indüklediği gösterilmiştir. Bu platformun vur-kaç doğası, hedefin DNA dizisi üzerindeki etkisinin olmaması ve talep üzerine DNA demetilasyonu ile baskıcı duruma geri dönme olasılığı, epigenetik susturmayı oyunun kurallarını değiştiren bir araç haline getiriyor. Kritik bir adım, hedef üzerinde susturmayı en üst düzeye çıkarmak ve hedef dışı susturmayı en aza indirmek için hedef gen üzerindeki uygun ETR’lerin konumunun belirlenmesidir. Bu adımın son ex vivo veya in vivo klinik öncesi ortamda gerçekleştirilmesi zahmetli olabilir.

CRISPR/katalitik olarak ölü Cas9 sistemini ETR’ler için paradigmatik bir DBD olarak alan bu makale, etkili hedef susturma için üçlü ETR kombinasyonuna bağlı kılavuz RNA’ların (gRNA’lar) in vitro ekranından oluşan bir protokolü açıklamaktadır. Bu, aday gRNA’ların ilk repertuarının, karmaşıklığı terapötik olarak ilgili ilgi ortamında nihai değerlendirmeleri için uygun olan umut verici olanların kısa bir listesine indirgenmesine izin verir.

Introduction

Gen inaktivasyonu, geleneksel olarak hem hücresel hem de hayvan modellerinde gen fonksiyonunu incelemek için önemli bir rol oynamıştır. Ayrıca, son yirmi yılda, gen terapisinin yükselişiyle birlikte, fonksiyon kazanımı mutasyonlarının1, bulaşıcı hastalıkların2 veya bir genin susturulmasının diğerinde kalıtsal bir kusuru telafi edebileceği patolojilerin neden olduğu hastalıkları tedavi etmek için potansiyel olarak oyunun kurallarını değiştiren bir yaklaşım olarak önerilmiştir3. Son olarak, kanser immünoterapisi4 ve rejeneratif tıp5 için hücre ürünlerinin etkinliğini artırmak için hücre uygunluğu ve fonksiyonel kontrolün temel düzenleyicilerinin genetik inaktivasyonu önerilmiştir.

Gen inaktivasyonunu gerçekleştirmek için farklı teknolojiler arasında en umut verici olanlardan biri, hedeflenen epigenetik susturmadır 6,7. Bu teknolojinin özünde, tasarlanmış transkripsiyonel baskılayıcılar (ETR’ler), programlanabilir bir DNA bağlama alanı (DBD) ve epigenetik baskılayıcı işleve sahip bir efektör alandan (ED) oluşan kimerik proteinler bulunur. Çinko parmak proteinleri (ZFP’ler)8, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektörler (TALE’ler)9 veya CRISPR/dCas910 tabanlı DBD’ler, ED’yi susturulacak hedef genin promotör / arttırıcı dizisine seçici olarak bağlamak için tasarlanabilir. Bir kez orada, ETR’nin ED’si, kullanılan baskılayıcı alana göre histon modifikasyonları (H3K9 11,12 veya H3K27 13 metilasyonu, H3 veya H4 deasetilasyonu 14) ve CpG DNA metilasyonu 15 gibi heterokromatini indükleyen baskılayıcı epigenetik işaretler uygulayarak susturma aktivitesini gerçekleştirir.

Özellikle, implantasyon öncesi embriyo16’da meydana gelen endojen retrovirüslerin kalıcı transkripsiyonel baskılanmasının moleküler süreçlerinden esinlenerek, aşağıdaki ED’lerden yararlanmak için üç ETR’nin bir kombinasyonu oluşturulmuştur: i) insan ZNF10’un Krüppel ile ilişkili kutu (KRAB) alanı; ii) insan de novo DNA metiltransferaz 3A’nın (DNMT3A) katalitik alanı; ve iii) tam uzunlukta insan DNA metiltransferaz 3 benzeri (DNMT3L). KRAB, susturma aktivitesi esas olarak KAP1 19-a iskele proteinini işe alma yeteneğine dayanan ve daha sonra nükleozom yeniden şekillenmesi ve deasetilasyon (NuRD) kompleksi20, H3K9 histon metiltransferaz SETDB122 ve H3K9 metilasyon okuyucusu HP123’ü içeren diğer birkaç heterokromatin indükleyicisi20 ile etkileşime giren yüksek omurgalılarda17,18 birkaç ZFP tarafından paylaşılan korunmuş bir baskılayıcı alandır, 24, diğerleri arasında.

DNMT3A, CpG dizileri25’te DNA üzerindeki metil gruplarını aktif olarak aktarır. DNMT3A’nın katalitik aktivitesi, metil grubu transferinden sorumlu katalitik alandan yoksun DNMT3A’nın embriyo ve germ hücresi kısıtlı bir paralogu olan DNMT3L ile fiziksel ilişkisi ile arttırılır26,27. Memeli genlerinin promotör/arttırıcı elemanlarına gömülü CpG adaları (CGI’lar) olarak adlandırılan CpG açısından zengin bölgelerde DNA metilasyonu genellikle transkripsiyon susturmaile ilişkilidir 28. Daha da önemlisi, bir kez biriktirildiğinde, CpG metilasyonu, UHRF1-DNMT1 bazlı bir moleküler kompleks29 tarafından mitoz boyunca stabil bir şekilde kalıtılabilir.

Hedef hücredeki ETR’lerin stabil aşırı ekspresyonu, muhtemelen hedef dışı aktivite risklerinin artması ve endojen interaktörlerin zaman içinde fizyolojik hedef bölgelerinden bastırılması nedeniyle sorunlu olabilir. Bununla birlikte, tek ETR kısımlarının geçici ekspresyonu, yüksek verimlilikle30 uzun süreli susturmayı indüklemekte başarısız olabilir ve terapötik uygulamalarını engelleyebilir. Bu nedenle, bu alanda çığır açan bir atılım, üç KRAB-, DNMT3A- ve DNMT3L tabanlı ETR’nin kombinasyonunun sinerji oluşturabileceğinin ve yalnızca geçici olarak birlikte verildiğinde bile, hedef gen H3K9 ve CpG metilasyonunun promotör dizisine dayatabileceğinin kanıtıydı. Bunlar daha sonra mitoz boyunca hücre tarafından okunur ve çoğaltılır, bu da çoklu insan ve murin hücre hatlarında kalıtsal susturmaya ve ayrıca ex vivo kültürlenmiş birincil hücrelereyol açar 30.

Dikkat edilmesi gereken, ETR’ler tarafından uygulanan epigenetik susturma, hedeflenen (örneğin, susturulmuş lokus üzerinde CRISPR / dCas9 bazlı TET1 DNA demetilazın alınması) veya farmakolojik (DNA metiltransferaz inhibitörü 5-Aza’nın uygulanması) DNA demetilasyonu30, ETR ile ilişkili advers olaylar durumunda potansiyel bir panzehir. Üç KRAB-, DNMT3A- ve DNMT3L tabanlı ED’yi taşıyan hepsi bir arada ETR’ler de tanımlandı ve protein kodlayan genlerin büyük çoğunluğuna karşı hücre hatlarında31,32 önemli susturma verimlilikleri gösterdi. Ayrıca, ETR’leri kullanan birkaç çalışma, de novo CpG metilasyonu veya kromatin erişilebilirliğinin değiştirilmesi açısından önemli bir hedef dışı aktivite olmaksızın yüksek bir güvenlik profili bildirmiştir30,31,32. Bununla birlikte, klinik uygulamalardan önce yeni tasarlanmış bir DBD ile donatılmış ETR’lerin özgüllük profilinin özel bir analizi önerilir.

Klinik açıdan bakıldığında, hedefli epigenetik susturma, hem RNA interferansı (RNAi) tabanlı yıkım33 hem de yapay nükleaz tabanlı gen bozulması8 için kritik avantajlar sağlayabilir. RNAi’nin aksine, hedeflenen epigenetik susturma, hücre başına hedefinin tamamen ortadan kaldırılmasına neden olabilir ve uzun süreli susturmayı sağlamak için periyodik tedavi gerektirmez; gen bozulmasının aksine, DNA dizisini değiştirmeden bırakır ve DNA çift iplikçik kırılmalarının (DSB’ler) oluşmasını önler. DSB’ler daha sonra apoptozu ve hücre döngüsü durmasını indükleyebilir, bu da potansiyel olarak fonksiyonel bir p53 yolu 34,35 olan hücrelere karşı bir seçime ve özellikle multipleks gen düzenleme ayarlarında kromozomal yeniden düzenlemelere35 yol açabilir. Ayrıca, homolog olmayan uç birleştirme aracılı DNA DSB onarımının geri dönüşümsüz mozaik sonucunu36 aktararak, gen bozulması, nihai sonuçlardan biri olarak hedefin fonksiyonel kodlama dizilerine çerçeve içi onarımını önleyemez ve epigenetik susturmanın aksine, talep üzerine silinemez.

Son olarak, epigenetik susturma, hedeflenebilir genetik elementlerin aralığını, kopyalanmamış düzenleyici elementler ve kodlamayan RNA’lar gibi RNAi’ye ve gen bozulmasına tamamen veya en azından kısmen dirençli sınıflara genişletme potansiyeline sahiptir30,32. Herhangi bir hedefli epigenetik susturma uygulaması için ilk kritik adım, hedef genin farklı düzenleyici dizilerini kapsayan bir ETR paneli tasarlamak ve en iyi performans gösterenleri belirlemektir. Test edilecek ETR’lerin sayısı, sürekli geliştirilmekte olan programlanabilir DNA bağlanma teknolojileri tarafından hedeflenebilecek genomun artan kısmı göz önüne alındığında çok önemli olabilir37. ETR’lerin taranmasının, hedef genin terapötik olarak susturulacağı hücre tipi üzerinde doğrudan gerçekleştirilmesi en uygun seçeneği temsil edecektir. Bununla birlikte, yüksek verimli ekranlar, kültürde sınırlı hayatta kalmaları ve genellikle yetersiz mühendislik kapasiteleri nedeniyle birincil hücrelerde teknik olarak hantal olabilir. Büyük ölçekli ekranlar in vivo olarak daha da olanaksız olabilir.

Daha pratik bir alternatif, ilk başta kolayca tasarlanabilir hücre hatlarında büyük bir ETR panelinin ilk taramasını yapmak ve daha sonra terapötik olarak ilgili hücre tipinde yalnızca en umut verici olanları doğrulamaktan ibarettir. Paralel bir sorun, ETR’lerin susturma verimliliğini ölçmek için uygun bir okumanın seçilmesidir. Hedef genin transkript veya protein seviyelerinin RT-qPCR, western blot veya ELISA ile doğrudan değerlendirilmesi maliyetli ve zaman alıcı olabilir ve yeterli duyarlılığa sahip olmayabilir, bu nedenle yüksek verimli ölçeklerde uygulamalarını sınırlayabilir. Hedef genin düzenleyici dizilerinin transkripsiyonel kontrolü altına bir floroforun yerleştirildiği özel olarak tasarlanmış raportör hücre hatlarının oluşturulması, epigenetik susturmayı tek hücre düzeyinde ve yüksek verimli hızda okumak için akış sitometrisine dayalı yaklaşımdan yararlanılmasına izin verir.

Bu genel hususları takiben, bu makale, hedef üzerinde susturma verimliliği için ETR’lerin in vitro dizili ekranından oluşan bir protokolü ve ardından en iyi isabetlerin genom çapında hedef dışı aktivitesinin değerlendirilmesini açıklamaktadır. Bu iş akışı, aday ETR’lerin ilk repertuarının, karmaşıklığı terapötik olarak ilgili hücre tipinde nihai değerlendirmeleri için uygun olan umut verici olanların kısa bir listesine indirgenmesine izin verir.

ETR’leri üretmek için kullanılabilecek farklı programlanabilir DBD’ler arasında, bu protokol, hedef gen promotörünü yüksek verimli bir ölçekte kapsayan gRNA’ları tasarlamanın kolaylığı nedeniyle CRISPR / dCas9 tabanlı teknolojiye odaklanacaktır. Bununla birlikte, diğer DBD’lerle donatılmış ETR’lerin verimliliğini ve özgüllüğünü değerlendirmek için aşağıda açıklanan aynı kavramsal iş akışı benimsenebilir.

Protocol

1. Akış sitometrisi ile hedef genin transkripsiyonel aktivitesini izlemek için floresan tabanlı bir raportör hücre hattının mühendisliği Susturulacak hedef geni ifade eden hücre hatlarını tanımlayın. İnsan Protein Atlası38’de susturulacak hedef gene göz atın ve ilgilenilen somatik dokuyu temsil eden çizgileri tanımlamak için “Hücre hattı” bölümünde gezinin (örneğin, nihai hedefler karaciğer hepatositleri ise bir hepatik hücre hattı). Alternatif olarak, halka açık bir RNA dizileme (RNA-Seq) veritabanını (örneğin, NCBI GEO) sorgulayın. Adaylar arasında, ETR iletimi için araçsal olan verimli geçici gen dağıtım protokollerinin mevcut olduğu hücre hatlarına öncelik verin.NOT: Farklı modaliteler arasında nükleofeksiyon, yüksek transfeksiyon verimliliği sağladığı için en iyi seçeneklerden birini temsil eder. Burada, insan eritrolösemi K-562 hücreleri, beta-2-mikroglobulin (B2M) geninin (bundan sonra B2MTdTomato K-562 hücreleri olarak anılacaktır) transkripsiyonel aktivitesini bildiren bir hücre hattı oluşturmak için seçilmiştir. Hedef genin hücre canlılığı için gerekli olduğu hücre hatlarından kaçınmak için adaylara daha fazla öncelik verin, çünkü bu, kültürde hedef genin kararlı bir şekilde susturulması ile hücrelerin bakımını bozar. Daha önce bildirilmemişse, seçilen hücre tipinde hedef genin gerekliliği hakkında bir fikir sahibi olmak için, hücreleri Cas9 nükleaz ve genin ilk kodlayan ekzonlarından birini hedefleyen bir gRNA ile transfekte ederek bir genetik bozulma kontrolü oluşturun.NOT: Genetik bozulma, tanımı gereği kararlı bir olaydır; Zaman içinde bozulan hücrelerin karşı seçimi, hedef genin seçilen hücrenin fizyolojisi için gerekli olduğunu gösterir.Seçilen hücre hattında tercihen kullanılan hedef ekleme izoformunu tanımlayın (bu protokolde B2M geninin izoform NM_004048.4’ü hedeflenir). Hedef izoformun ilk kodlama eksonunu etkili ve spesifik bir şekilde kesebilen bir gRNA tanımlayın (örneğin, geçerli ve kullanıcı dostu bir çevrimiçi gRNA seçim aracı olan Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39). K-562 hücreleri için, nükleofeksiyon yoluyla 5 × 105 hücre başına 1 μg spCas9 kodlayan plazmit (hCas9; Malzeme Tablosuna bakınız) ve 250 ng gRNA kodlayan plazmid (phU6-gRNA; Malzeme Tablosuna bakınız) transfekte edin. Hücreleri kültürleyin ( fetal sığır serumu [FBS], L-glutamin ve penisilin/streptomisin [100 U/mL] ile desteklenmiş RPMI-1640’ta %5 CO2 altında 37 °C’de K-562 hücreleri) ve bir mutasyon tespit kitinden yararlanarak zaman içinde gen bozulma seviyelerini izleyin (üreticinin talimatlarını izleyin). İlgilenilen hedef genin transkripsiyonel kontrolü altında bir floresan raportörün homolog rekombinasyon aracılı entegrasyonu için bir donör şablonunu klonlayın (Şekil 1).Florofor ekspresyon kasetini entegre etmek için hedef genin bölgesini tanımlayın.NOT: H3K27 asetilasyonu için zenginleştirilmiş CpG adaları ve bölgeleri (aktif promotörlerin ve arttırıcıların belirteci) gibi transkripsiyonla ilgili öğeleri hedeflemekten kaçının. Bu düzenleyici unsurların değiştirilmesi (epigenetik susturma talimatı vermek için ETR’ler tarafından hedeflenmesi potansiyel olarak önemlidir), raportör hücre hattını hedef genin fizyolojik düzenlemesini daha az öngörücü hale getirir.Hedef gen, salgılanan bir proteini kodlamazsa, hedef genin işlevselliğini korumak için raporlayıcıyı hedef genin son kodonuna 2A kendi kendini parçalayan bir peptit aracılığıyla kaynaştırın. Hedef gen salgılanan bir proteini kodluyorsa, raportörün potansiyel salgılanmasını önlemek için, raportörü hedef genin tronik bir bölgesine yerleştirin. Raportörün bir ekleme alıcı bölgesi (SA) yoluyla eklenmiş transkripte zorla entegrasyonu ve ardından bir dahili ribozom giriş dizisi (IRES) yoluyla translasyon, hedef genin işlevselliğini bozar. Hedef bölgede gRNA kesimini seçmek için Chopchop’u kullanın (burada, B2M geninin ilk intronunun 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ dizisini hedeflemek için bir gRNA seçilir). gRNA kesim bölgesi için aşağıdakilerden oluşan bir donör şablonu tasarlayın: i) bir sol homoloji kolu (gRNA kesim bölgesinin hemen yukarısındaki bölgeyle eşleşen n baz çifti [bp]); ii) promotörsüz bir transgen ekspresyon kaseti (burada gösterilen durumda, B2M geninin ilk intronu ile uçbirleştirmeyi destekleyen bir SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poli(A)); ve iii) bir sağ homoloji kolu (gRNA kesim bölgesinin akış aşağısındaki bölgeyle eşleşen n bp).NOT: Homolog rekombinasyonu etkili bir şekilde indüklemek için gerekli olan homoloji kollarının uzunluğu, farklı hücre tipleri arasında değişebilir (100-500 bp, K-562 hücreleri için uygun bir aralıktır). CRISPR / Cas9 nükleaz sistemini ve donör şablonunu hedef hücre hattının içine iletin. K-562 hücreleri için, 1 μg spCas9 kodlayan plazmid (hCas9; Malzeme Tablosuna bakınız), 250 ng gRNA kodlayan plazmid (phU6-gRNA; Malzeme Tablosuna bakınız) ve nükleofeksiyon yoluyla 5 × 105 hücre başına 1 μg donör şablon kodlayan plazmid (üreticinin talimatlarına göre). Hücreleri en az 14 gün boyunca kültürleyin (K-562 hücreleri için) ve bir akış sitometresi kullanarak floresan raportörün zaman içindeki ekspresyon seviyelerini izleyin (tdTomato raportörünün floresan yoğunluğunu ölçmek için fikoeritrin (PE) kanalını etkinleştirin ve akış sitometrisi yapmak için üreticinin talimatlarını izleyin).NOT: Donör şablonu – özellikle plazmid tabanlıysa – kriptik promotör dizileri içerebilir ve bu da entegre olmayan donör kopyalarından floresan raportörün ekspresyonuna yol açar. Hücrelerin kültürlenmesi, bu entegre olmayan kopyaların hücre bölünmesi ile seyreltilmesine ve son olarak raportörün ekspresyonunun yalnızca hedef genoma entegre edilmiş donör kopyalarından korunmasına izin verir. Tek hücre düzeyinde floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması (FACS) yoluyla raportör pozitif hücreleri klonlayın. Bu protokol için, tdTomato raporlayıcısının floresan yoğunluğunu ölçmek için PE kanalını etkinleştirin ve 96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına tek tdTomato-pozitif K-562 hücrelerini sıralamak için üreticinin talimatlarını izleyin. Kültürde hücre genişlemesi üzerine (tipik olarak K-562 hücreleri için 20-30 gün), hedef lokus içindeki raportör kasetinin bi-alelik entegrasyonunu taşıyan birini seçmek için PCR ile raportör pozitif klonları tarayın.NOT: Bu, raportör ekspresyonunu en üst düzeye çıkarır ve ETR tedavisi üzerine akış sitometrisi ile muhabir eksprese eden ve muhabir susturulmuş hücreler arasında daha fazla çözünürlüğü kolaylaştırır.Bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak (üreticinin talimatlarını izleyerek) raportör pozitif klon başına 1 × 105 hücreden genomik DNA’yı çıkarın. PCR amplifikasyon kitinin talimatlarını izleyerek ileri (5′-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3′) ve geri (5′-AATGGTTGAGTTGGAC-3′) primerlerle B2M hedef bölgesini yükseltin. Bu primer çifti için tavlama sıcaklığı, Thak bazlı DNA polimerazlar ve 0.5 μM primer konsantrasyonları ile 47.7 °C’dir. PCR ürününü %1 agaroz jel elektroforezi kullanarak analiz edin (üreticinin talimatlarını izleyerek). Vahşi tip hedef lokusla (1.027 bp) ilgili bant olmadan, tdTomato’nun B2M hedef lokusuna (3.413 bp) entegrasyonu ile ilgili bandı gösteren klonlar için ekran. 2. Hedef genin CRISPR/dCas 9 tabanlı epigenetik susturulması için gRNA’ların tasarlanması UCSC genom tarayıcısında40 hedef gene göz atın ve CpG adaları ve H3K27 asetilasyonu için zenginleştirilmiş bölgeler (aktif promotörlerin ve arttırıcıların belirteci) gibi transkripsiyonel aktivitesini potansiyel olarak düzenleyen bölgelerin nükleotid dizisini çıkarın.NOT: Yakın zamanda yapılan bir araştırmaya göre, en iyi hedefleme bölgesi, hedef gen32’nin transkripsiyon başlangıç bölgesine odaklanan 1 kilobaz (kb) penceresidir. Seçilen dizileri Chopchop çevrimiçi aracına yapıştırın ve alınacak gRNA’ların amacı olarak baskılamayı seçin. Chopchop’un, ilgilenilen genetik diziye göre eşlenen ve hem hedef dışı eşleşmelerin sayısını hem de tahmin edilen hedef üzerindeki verimliliği dikkate alan bir puana göre listelenen gRNA’ların bir listesini sağlamasını bekleyin (Şekil 2). Hedef dizi başına en az 10 gRNA seçin. Mümkünse, sorgulanacak tüm bölgeye yayılan gRNA’ları, genom boyunca diğer intragenik dizilerle tam eşleşme olmadan seçmeye çalışın. 3. Raportör hücre hattında CRISPR/dCas 9 tabanlı ETR’lerin dizili geçici iletimi Hedef hücre hattı için daha önce bildirilen transgen dağıtım sistemleri arasından, yalnızca geçici transgen ekspresyonuna izin veren, dağıtım verimliliğini en üst düzeye çıkaran ve hücre manipülasyonu ile ilgili toksisiteyi en aza indirenleri seçin. K-562 hücreleri söz konusu olduğunda, hem plazmit hem de mRNA nükleofeksiyonu şiddetle tavsiye edilir, plazmit üretimi teknik olarak daha kolay ve daha ucuz bir alternatifi temsil eder. Hem bölüm 2’de seçilen gRNA’ları hem de CRISPR/dCas9 tabanlı ETR’leri tercih edilen transgen dağıtım sisteminde klonlayın. Plazmit DNA’lardaki ETR’leri klonlamak için bir protokol için aşağıdaki adımlara bakın.NOT: dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A ve dCas9:DNMT3L30 için ayrı ayrı kodlanan plazmitler Addgene’de mevcut değildir. Plazmid pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41’den VP160 trans-aktivatörü (Malzeme Tablosuna bakınız) KRAB, DNMT3A veya DNMT3L alan kodlama dizisi30 ile değiştirilerek klonlandılar. CRISPRoff-v2.132 olarak adlandırılan hepsi bir arada ETR için bir plazmit kodlaması mevcuttur (bkz.Kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerinde ETR’leri kodlayan plazmitleri dönüştürün (üreticinin talimatlarını izleyerek). Restriksiyon enzimi sindirimi ve Sanger dizilimi ile kolonileri ETR içeren plazmidin varlığı açısından tarayın ve son olarak plazmid DNA Midiprep üretimi için pozitif kolonilerden birini seçin (üreticinin talimatlarını izleyerek). phU6-gRNA omurgası içindeki gRNA’ları klonlayın (Şekil 3).Moleküler biyoloji tasarım yazılımını kullanarak, SGfw olarak adlandırılan 25 nt uzunluğunda bir oligo in silico oluşturmak için protospacer’ın (seçilen gRNA’nın ilk değişken 20 nükleotidi [nt]) yukarı akışında bir 5′-CACCG-3′ dizisi ekleyin. Benzer şekilde, SGrv olarak adlandırılan 25 nt uzunluğunda bir oligo oluşturmak için, seçilen gRNA’nın ön-aralayıcısının ters tamamlayıcısının yukarı akışında bir 5′-AAAC-3′ dizisi ve bunun aşağı akışında bir 5′-C-3′ dizisi ekleyin. Hem SGfw hem de SGrv dizilerini, 100 μM’de suda yeniden süspanse edilmiş, tuzsuz tek sarmallı DNA oligoları olarak sipariş edin. 2 μL tavlama tamponuna (10 mM Tris [pH 7.5-8.0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) ve 16 μL suya her oligodan 1 μL ekleyin. Çözeltiyi 10 dakika boyunca 95 °C’de başlayacak şekilde programlanmış bir termodöngüleyiciye yerleştirerek oligo tavlama gerçekleştirin. Ardından, 45 dakika boyunca kademeli olarak 25 °C’ye soğutun. Tavlanmış oligoların 1 μL’sini 99 μL nükleaz içermeyen su ile seyreltin ve ardından bu seyreltmenin 1 μL’sini daha önce BsaI kısıtlama enzimi ile sindirilmiş 50 ng phU6-gRNA plazmidi ile bağlayın (sindirim ve ligasyon prosedürü için BsaI ve ligaz kiti satıcılarının talimatlarını izleyin). 20 μL kimyasal olarak yetkin E. coli hücrelerini 2 μL ligasyon ürünü ile dönüştürün (dönüşüm prosedürü için üreticinin talimatlarını izleyin). Plazmid DNA Miniprep üretimi için birden fazla koloni seçin (satıcının talimatlarını izleyin) ve U6 promotörü 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3′ ile eşleşen aşağıdaki primer ile Sanger dizileme ile protospacer’ın başarılı klonlanmasını kontrol edin. Plazmid DNA Midiprep üretimi için pozitif kolonilerden birini seçin (üreticinin talimatlarını izleyerek). Seçilen gRNA’ları ve CRISPR/dCas9 tabanlı ETR’leri raportör hücre hattında dizi halinde iletin (koşul başına belirli bir gRNA) (Şekil 3).NOT: Temsili bir durum olarak, B2MTdTomato K-562 hücrelerinde B2M CpG adasını hedefleyen dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ve gRNA’ları kodlayan plazmitlerin nükleofeksiyonu için iş akışı aşağıdaki adımlarda gösterilmiştir.dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- ve dCas9:DNMT3L kodlayan plazmitlerin her birinden 500 ng içeren, ancak test edilecek gRNA için farklılık gösteren (tüp başına 125 ng gRNA kodlayan plazmit) ayrı tüpler hazırlayın. Sahte muamele edilmiş numune olarak gRNA ve ETR içermeyen bir nükleofeksiyon koşulu ekleyin. Ekranı örnek başına en az üç teknik kopya ile gerçekleştirin. Tüp başına 5 × 105 B2M TdTomato K-562 hücrelerini pelet haline getirin ve bunları plazmid karışımı ile nükleofect edin (üreticinin talimatlarına uyarak). Hücreleri 200 μL önceden ısıtılmış RPMI-1640 memeli hücre kültürü ortamında yeniden süspanse edin ve inkübatöre geri yerleştirin. 4. Hedef genin zaman içindeki transkripsiyonel aktivitesinin analiz edilmesi ETR’lerin verilmesinden sonra farklı zaman noktalarında susturulmuş hücrelerin yüzdesini ölçmek için akış sitometrisini kullanın (Şekil 4). Raportör negatif hücrelerin eşiğini ayarlamak için florofor kodlama dizisini taşımayan vahşi tip (WT) hücreleri kullanın. Raportör pozitif hücreler için kapıyı ayarlamak için sahte işlem görmüş numuneyi kullanın.NOT: Adım 1.3’te önerildiği gibi, deneye bir genetik bozulma kontrolü ekleyin. Bu, hem CRISPR dağıtım verimliliğini hem de hedef genden yoksun hücrelerin uygunluğunu izlemek için yararlı olabilir; Zaman içinde hem transkripsiyonel susturma hem de genetik bozulma kaybı, seçilen hücre tipinde hedef genin gerekliliğine bağlanabilir. Susturmanın hem akut hem de uzun vadeli etkinliğinin bir göstergesini elde etmek için hem kısa (3. gün, 7. gün, 10. gün) hem de uzun vadeli (21. gün, 35. gün) zaman noktalarını ekleyin. Uzun vadeli susturma verimliliği açısından ilk üç gRNA’yı tanımlayın. Bu örneklerde kararlı bir şekilde tutulan muhabir-negatif alt popülasyonu seçmek için FACS’yi kullanın. Ayrıca, sonraki analizlerde uygun karşılaştırmaya izin vermek için toplu sahte işlem görmüş numunelerin FACS’sini test numuneleriyle aynı işlem altında tutmak için gerçekleştirin. 5. ETR tedavisinin özgüllüğünün RNA-seq ve metillenmiş DNA immünopresipitasyon (MeDIP)-seq ile değerlendirilmesi ETR iletimi üzerine herhangi bir nihai genom çapında transkripsiyonel deregülasyonu değerlendirmek için RNA-seq kullanın.En iyi performans gösteren üç gRNA ile muamele edilen numunelerin hem muhabir tarafından susturulmuş alt popülasyonu hem de sahte muamele edilmiş hücreler için, ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak RNA’yı çıkarın. Piyasada bulunan kitleri kullanarak RNA’nın kalitesini ve konsantrasyonunu değerlendirin. RNA-seq kitaplıklarının hazırlanması için ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak (üreticinin talimatlarını izleyerek) RNA parçalanması, retrotranskripsiyon ve kitaplık hazırlığı gerçekleştirin. Yeni nesil dizileme ve dijital elektroforez ile uyumlu kalite kontrol araçlarını kullanarak kütüphane niceleme ve kalite kontrolü gerçekleştirin. Üreticinin talimatına uygun olarak, 100 bp eşleştirilmiş uç protokolüne sahip ve ortalama 45 M okuma/örnek hedefleyen yeni nesil bir sıralayıcıda dizi kitaplıkları. Okuma etiketlerini uygun referans genomuna hizalayın ve transkript ifadesini ölçün. tdTomato dizisi üzerinde hizalama gerçekleştirin ve ayrı ayrı nicelleştirin.NOT: Burada, varsayılan parametrelere sahip STAR hizalayıcı (v 2.3.0)43, Rsubread paketi44’e bağlı olarak kullanılır. Yayınlanmış en iyi uygulamalara göre RNA-seq verilerinin analizini gerçekleştirin45.NOT: R/Bioconductor paketi edgeR46 burada kullanılır ve düşük eksprese edilen genleri atmak için en az üç numunede milyonda en az bir sayım (cpm) filtresi uygulanır. Alternatif olarak, edgeR’deki filterByExpr işlevi de kullanılabilir. Diferansiyel gen ekspresyonunu negatif binom genelleştirilmiş log-doğrusal model kullanarak değerlendirin edgeR (fonksiyon glmFit)47. Diferansiyel olarak düzenlenmiş genleri korumak için ayarlanmış p değerlerinde (Benjamini-Hochberg [BH] düzeltmesi) 0.01’lik bir eşik ayarlayın. ETR’lerin nihai hedef dışı CpG metilasyon aktivitesini MeDIP-seq ile değerlendirin.İlk üç gRNA ile muamele edilen numunelerin hem muhabir tarafından susturulmuş alt popülasyonu hem de sahte muamele edilmiş hücreler için, ticari olarak temin edilebilen kitleri kullanarak (üreticilerin talimatlarını izleyerek) genomik DNA’yı çıkarın. Bir ultrasonicator ve aşağıdaki parametreleri kullanarak 500 ng genomik DNA sonicate: Görev:% 20; PIP: 175; Seri Çekim Başına Döngü Sayısı: 200; Süre: 40 sn. MeDIP-seq için piyasada bulunan kitlerle sıralama kitaplıkları hazırlayın (üreticinin talimatlarını izleyerek). Adaptör ligasyon adımından sonra, kütüphaneleri florometrik tahlil ile ölçün ve piyasada bulunan kütüphane miktar tayin kitlerini kullanarak (üreticinin talimatlarını izleyerek) qPCR ile ligasyon verimliliğini kontrol edin. Teknik önyargıları azaltmak için rastgele seçilen kitaplıkları karıştırarak kitaplık havuzları elde edin. Havuzları dengelemek için her kitaplık için eşit bir kitaplık miktarı (ng) kullanın. Her havuza, kitte sağlanan metillenmiş ve metillenmemiş spike-in kontrol DNA’sını ekleyin. Kontrol amacıyla, kitaplığın ‘luk bir hacmini, “giriş” olarak etiketlenmiş ve immünopresipite edilmemiş olarak tutun. MeDIP-seq kitinde sağlanan 5-metilsitozine karşı yönlendirilmiş monoklonal antikoru kullanarak kütüphanenin kalan% 90’ında immünopresipitasyon gerçekleştirin. Üreticilerin talimatlarını izleyerek, 5-metilsitozin immünopresipitasyon ürününün saflaştırılması için kitleri kullanarak zenginleştirilmiş ve girdi kitaplıklarını saflaştırın. Kit ile birlikte verilen primerleri kullanarak kontrollerdeki dahili ani artış üzerinde kantitatif gerçek zamanlı PCR gerçekleştirerek zenginleştirme verimliliğini değerlendirin. Her immünopresipitasyon (IP) için, MeDIP’in döngü eşiği (Ct) değerlerini ve qPCR reaksiyonundan elde edilen girdi fraksiyonlarını kullanarak metillenmiş ve metillenmemiş DNA’nın geri kazanımından zenginleştirme özgüllüğünü hesaplayın (bkz. denklem 1 ve 2): (1) (2)NOT: Özgüllük değerleri ≥0.95 ise IP kitaplıklarının başarılı olduğunu düşünün. Üreticilerin talimatlarını izleyerek MeDIP-seq kitaplık hazırlama kitlerini kullanarak kitaplıkları güçlendirin ve ürünün nicelleştirme ve kitaplık boyutu dağılım analizini gerçekleştirin. Yeni nesil sıralayıcılarda kitaplık sıralaması gerçekleştirin. Ortalama 30 M okuma/örnek hedefleyen, 100 bp okuma uzunluğuna sahip eşleştirilmiş uç sıralaması kullanın. Sıralama okuma etiketlerini bwa (v 0.7.5 veya üstü)48 kullanarak uygun referans genomuna (örneğin, hg38) hizalayın ve ardından MACS (v 2.0.10 veya üstü)49 kullanarak tepe noktalarını tanımlayın, böylece geniş tepe noktalarının tanımlanmasına izin verin (-slocal = 0,-llocal = 500000). BEDTools’un çoklu kesişim aracını50 kullanarak kümeleme seçeneğini etkinleştirerek farklı örneklerden ortak bir bölge kümesi oluşturun. BEDTools’un multicov’unu kullanarak son bölge listesi üzerinden örnek başına kapsamı hesaplayın ve yinelenen okumaları atın. edgeR kullanarak matris sayısının analizini gerçekleştirin. Düşük zenginleştirilmiş bölgeleri atmak için en az üç örnekte milyonda en az bir sayım (bgbm) filtresi uygulayın.NOT: Alternatif olarak, edgeR’deki filterByExpr işlevi kullanılabilir. edgeR’de (glmFit işlevi) uygulanan genelleştirilmiş log-doğrusal modeli benimseyerek ve bölge bazında GC içeriğini düzeltmek için koşullu kantil normalleştirme51 kullanarak normalleştirerek diferansiyel metilasyonu tanımlayın. BH ayarlı p değerlerine 0.01’lik bir eşik uygulayarak diferansiyel olarak metillenmiş bölgeleri seçin. Tekrarlanan dizilerin analizini aşağıdaki gibi gerçekleştirin.NOT: Seçeneklerin ve parametrelerin tam listesi için edgeR kullanıcı kılavuzuna bakın (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).MeDIP-seq sonuçlarını nominal p değeri 1’e sahip bölgeleri ve ikinci kümede logFC <-1'e sahip bölgeleri seçin. Seçilen genom için RepeatMasker ek açıklamasını bir yatak dosyası olarak alın ve her kümedeki öğelerin sayısını sayın. Sayıyı, her veri kümesinin bölge sayısı üzerinden bir oran olarak dönüştürün. Her bir tekrar sınıfıyla örtüşen metilom oranını çıkarın ve herhangi bir önemli zenginleşmeyi tespit etmek için bir Ki-kare testi gerçekleştirin. ETR ve sahte muamele edilmiş numuneler arasındaki diferansiyel olarak kopyalanmış veya diferansiyel olarak metillenmiş bölgelerin, in silico olarak tahmin edilen hedef dışı gRNA bağlanmasıyla eşleşip eşleşmediğini değerlendirin.Hedef dışı gRNA bağlama tahmin aracı olarak CRISPR tasarım paketi52’yi kullanın. Her varsayılan hedef dışı bölge için, en yakın transkripsiyon başlangıç bölgesine (TSS) ve en yakın metillenmiş bölgeye bakın. Gerçek bir hedef dışı etki olarak, FDR <0.01 ile düzenlenmiş bir gen ve TSS'ye 10 Kb'den küçük bir mesafe veya FDR <0.01 ile düzenlenmiş ve 1 Kb'den daha düşük bir mesafe ile düzenlenmiş metillenmiş bir bölge ile ilişkili bir bölge düşünün. gRNA’lar arasında en spesifik olanı belirlemek için, sahte muamele edilmiş numunelere kıyasla en iyi performans gösteren üç gRNA’nın her biri ile muamele edilen numunelerde transkripsiyonel olarak değiştirilmiş veya aşırı metillenmiş bölgelerin sayısını ve özelliklerini tanımlayın (Şekil 5). Hedef dışı bir bölgenin hedef hücrelerin fizyolojisi üzerindeki potansiyel etkisini aşağıdaki sırayla sıralayın (en çok etkileyenden daha az etkileyene doğru):i) İntravenik, düzenleyici bölge-fizyolojik olarak eksprese edilen genii) İntravenik, ekzonik bölge-fizyolojik olarak ifade edilen geniii) İntrojenik, intronik bölge-fizyolojik olarak eksprese edilen geniv) İntravenik, düzenleyici bölge-eksprese edilmemiş genv) İntrojenik, ekzonik bölge-eksprese edilmemiş genvi) İntrojenik, intronik bölge-eksprese edilmemiş genvii) İntergenik bölge

Representative Results

CRISPR/Cas9 sistemi ile birleştirilmiş floresan raportörün hedef lokusa homolog rekombinasyon aracılı entegrasyonu için bir donör şablonunun verilmesi üzerine (ör., K-562 hücreleri durumunda plazmit nükleofeksiyonu ile), tedavi edilen numunede raportör pozitif hücreler görünür (Şekil 1, alt). Bu gerçekleşmezse, hem donör şablonunun hem de CRISPR/Cas9 reaktiflerinin tasarımının ve klonlanmasının doğruluğunu tekrar kontrol edin. Onaylanırsa, reaktiflerin dozlarını ve dağıtım protokolünün kendisini optimize etmeye çalışın. Raportör hücre hattı elde edildikten sonra, hedef genin promotör/arttırıcı dizilerini seçin ve eşleşen gRNA’lardan oluşan bir panel tasarlayın. Hem gRNA dizilerini tanımlamak hem de bunları tahmin edilen verimlilik ve özgüllük açısından sıralamak için Chopchop gibi in silico tahmin araçlarını kullanın (Şekil 2). Hiçbir gRNA alınmazsa, hedef dizide kanonik Cas9 protospacer bitişik motifinin (PAM) (5′-NGG-3′) varlığını kontrol edin. Herhangi bir PAM dizisi yoksa, alternatif PAM’den bağımsız Cas9 varyantlarına (henüz bu varyantlarla yayınlanmış ETR’ler yok) dayalı ETR’lere geçmeyi veya ZFP’ler53 veya TALE’ler30 gibi alternatif DNA bağlanma alanı platformlarına geçmeyi düşünün. Bununla birlikte, yalnızca düşük tahmin edilen etkinlik/özgüllüğe sahip gRNA’lar elde edilirse, daha iyi gRNA’lar aramak için 1) bu düşük kaliteli gRNA’ları test etmeyi veya 2) hedef DNA dizisini genişletmeyi düşünün. Üçlü ETR kombinasyonunun (veya CRISPRoff; v2.1) gRNA’larla birlikte geçici olarak verilmesi üzerine, floresan raportörün ekspresyonu için uzunlamasına akış sitometrisi analizleri gerçekleştirin, genellikle akut analizlerde raportör baskısında bir zirve gözlemleyin, bu daha sonra ETR kodlayan plazmitlerin zaman içinde mitotik seyreltilmesi nedeniyle en azından kısmen yeniden emilir (Şekil 4C). ETR’ler/gRNA kombinasyonu, CpG metilasyonunu hedef lokus üzerinde etkili bir şekilde biriktirirse, tedavi edilen hücrelerin oldukça büyük bir kısmında raportörün kalıcı baskısı meydana gelecektir (Şekil 4C). Farklı gRNA’lar, değişken uzun süreli susturma etkinliği gösterebilir (Şekil 4B,C). Genom çapında özgüllük değerlendirmeleri için, hedefin uzun süreli susturulmuş ve tedavi edilmemiş hücreler olduğu hücreler arasındaki diferansiyel olarak metillenmiş bölgeleri tanımlamak için MeDIP-seq kullanın. İdeal olarak, oldukça spesifik bir gRNA, hedef bölgede yalnızca bir de novo CpG metilasyonu zirvesini indükleyecektir (Şekil 5). Değilse, hedef verimlilik listesinde daha düşük bir konumda yer alan gRNA’ların hedef dışı aktivitesinin karakterize edilmesi düşünülebilir. Şekil 1: Bir tdTomato raportörünün homolojiye yönelik onarım ile insan B2M geninin düzenleyici unsurları altında entegrasyonu. Üstte: CRISPR/Cas9 kaynaklı homolojiye yönelik onarım ile insan B2M geninin ilk intronuna bir tdTomato floresan raportörünü entegre etme stratejisinin şemaları. Altta: B2M geninin ilk intronunda tdTomato raportörünün entegrasyonu öncesi ve sonrası K-562 hücrelerinin temsili nokta grafikleri. Kısaltmalar: HA = homoloji kolu; HDR = homolojiye yönelik onarım; IRES = iç ribozom giriş bölgesi; pa = BGH poli(A); SA = ekleme alıcı sitesi; WT = vahşi tip; 3XSTOP = üç tandem durdurma kodonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: B2M geninin CpG adasını hedefleyen gRNA’ların in silico olarak tanımlanması, tahmin edilen verimlilik ve özgüllük açısından sıralanmıştır. Chopchop’un B2M geninin promotör dizisine gömülü CpG adasını hedefleyen gRNA’ları gösteren çıktı arayüzü, hem 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) veya 3 (MM3) uyumsuzluklu hedef dışı dizilerin sayısı hem de tahmin edilen hedef verimlilik için sıralanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: dCas9 ETR aracılı epigenetik susturma için gRNA’ların klonlanması ve dizili nükleofeksiyonu. Üstte: plazmid eksprese eden bir insan U6-gRNA’sında oligo aracılı protospacer klonlaması. Alt: K-562B 2 M/tdTomato hücrelerinde plazmit nükleofeksiyonu ile CRISPR/dCas9 tabanlı epigenetik susturma için B2M hedefleme gRNA’larının dizili ekranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: B2M geninin uzun süreli susturulmasını etkili bir şekilde indükleyen gRNA’lar için tarama. (A) Üst: genişlemiş alanda gösterilen B2M tdTomato geninin şemaları, gRNA’larla komplekslenmiş dCas9 tabanlı ETR’lerin bağlanmasının göreceli sırası ve oryantasyonu. Alt: ETR susturmadan önce (solda) veya sonra (sağda)B2M tdTomato K-562 hücrelerinin temsili nokta grafikleri. Transfeksiyondan 30 gün sonra, gRNA’ları kodlayan plazmitler ve üçlü dCas9:KRAB+dCas9:D3A + dCas9:D3L kombinasyonu ile analizler. (B) Transfeksiyondan sonraki 30. günde K-562 B2MtdTomato hücrelerinde B2M’nin CpG adasını (üst şemadaki kırmızı oklar gRNA’ların yönünü gösterir) hedefleyen belirtilen gRNA’ların (havuzlarda veya ayrı gRNA’lar olarak) susturma aktivitesi. Veriler, tdTomato-negatif hücrelerin yüzdesini gösterir (ortalama ± SEM; n = her tedavi koşulu için dört bağımsız transfeksiyon). (C) Üçlü ETR kombinasyonunu ve belirtilen B2M CpG ada hedefleme gRNA’larını veya sahte (gRNA ve ETR içermeyen transfeksiyonu) eksprese eden plazmitlerle transfeksiyon üzerine B2M tdTomato K-562 hücrelerinin zaman seyri analizi. Veriler, tdTomato-negatif hücrelerin yüzdesini gösterir (ortalama ± SEM; n = her tedavi koşulu için üç bağımsız transfeksiyon). Yayımlanmamış veriler. Paneller A ve B, Amabile ve ark.30’dan uyarlanmıştır. Kısaltmalar: CGI = CpG adası; IRES = iç ribozom giriş bölgesi; pa = BGH poli(A); SA = ekleme alıcı sitesi; SD = ek yeri donör bölgesi; TSS = transkripsiyon başlangıç sitesi; UT = transfekte edilmemiş; 3XSTOP = 3 tandem durdurma kodonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: RNA-seq ve MeDIP-seq ile ETR özgüllüğünün genom çapında analizi. Solda: sahte muamele edilmiş B2MtdTomato K-562 hücrelerinde ve üçlü dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR kombinasyonu ve B2M geninin CpG adasını hedefleyen bir gRNA ile muamele edilen hücrelerde ekspresyon seviyelerinin karşılaştırılması. Değerler, eşlenen okumaların milyonu başına kilobase başına okumaların log2’si (RPKM) olarak ifade edilir. Siyah noktalar, her koşulda karşılaştırılabilir seviyelerde ifade edilen genleri temsil eder; sarı daireler, bir FDR <0.01 altında farklı şekilde düzenlenen genleri temsil eder; kırmızı daire, B2M-IRES-tdTomato transkriptini temsil eder. Sağ üst: sahte işlem görmüş B2MtdTomato K-562 hücrelerinin (mavi) veya üçlü dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR kombinasyonu ve B2M geninin (yeşil) CpG adasını (CGI) hedefleyen bir gRNA ile tedavi edilen hücrelerin tüm genom MeDIP-seq profillerini gösteren sirk grafiği. Sağ alt: Belirtilen numunelerdeki B2MtdTomato lokusunun metilasyon durumu gösterilmektedir. Her yığında üç kopya temsil edilir; Hizalanmış okumaların yığılması, bir Gauss penceresi kullanılarak düzleştirildi. Bu rakam Amabile ve ark.30’dan uyarlanmıştır. Kısaltma: TSS = transkripsiyon başlangıç sitesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Hedefe yönelik epigenetik susturma, fonksiyon kazanımı mutasyonlarının neden olduğu hastalıklar1, bulaşıcı hastalıklar2 ve bir genin susturulmasının diğerinde kalıtsal bir kusuru telafi edebileceğipatolojiler de dahil olmak üzere kalıcı gen inaktivasyonundan yararlanabilecek bozuklukları tedavi etmek için umut verici bir çözüm sunabilir 3 veya evlat edinen hücre tedavilerinin tüm potansiyelini açığa çıkarabilir4, 5. Kromatin seviyesinde hareket ederek vehücre 7,30,32 tarafından otomatik olarak çoğaltılarak, epigenetik susturma, hedef genin DNA dizisindeki toksik değişiklikleri (örneğin, kromozomal yeniden düzenlemeler) ve hedefin kısmi, geçici susturulmasını önleyebilir, bunlar sırasıyla yapay nükleaz bazlı gen bozulmasının 8,34,35 ve RNAi bazlı yıkım 33’ün sınırlamalarıdır.

Herhangi bir epigenetik susturma protokolündeki en önemli ön adımlardan biri, hedefin transkripsiyonel aktivitesini kapatmak için gerekli baskılayıcı epigenetik işaretleri bırakacak ETR’leri yönlendirmek için hedef gen üzerindeki uygun konumu belirlemektir. Farklı transkripsiyonel başlangıç bölgesi-proksimal ve -distal düzenleyici unsurlar, belirli bir insan geninin transkripsiyonel çıktısını desteklemek için aynı fikirde olabilir54. Ayrıca, artan sayıda programlanabilir DNA bağlanma teknolojisi sayesinde belirli düzenleyici eleman başına farklı hedef bölgeler artık tanımlanabilmektedir6. Bu nedenle, burada tasarlanmış hücre hatlarında tarif edilenler gibi protokoller, nihai terapötik ortamda en iyi adayların hantal ve zaman alıcı değerlendirme çabalarına başlamadan önce, ETR aracılı epigenetik susturmaya uygun bireysel hedef bölgeleri ve / veya genomik bölgeleri aday göstermek için kullanılabilir. Protokolün bazı kritik yönleri aşağıda daha ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Nihai terapötik hedefi öngören bir raportör hücre hattının mühendisliği
Floresan raportör için kaset kodlamasını hedef gene yerleştirmek ve ETR’leri iletmek için gerekli olan hücre mühendisliği protokollerinin sürekli optimizasyonuna rağmen, nihai terapötik hedefe en çok benzeyen hücre hattı için zaten mevcut olabilecekleri kabul edilemez. Bu durumda, farklı azaltma stratejileri uygulanabilir: a) hedef hücre hattı için transfeksiyon protokolünü kurum içinde optimize etmek için satıcılar tarafından sağlanan optimizasyon kitlerinden yararlanmak; b) Hala bu hedef geni eksprese eden, ancak mühendislik protokollerinin kapsamlı bir şekilde optimize edildiği nihai terapötik hedef dışındaki dokulara ait olan diğer hücre hatlarına geçmek. Bu seçeneklerin mevcut olmaması durumunda, nihai hedefi temsil eden birincil hücre tiplerine veya organoidlere geçiş düşünülebilir. ETR tabanlı epigenetik susturmanın hem klinik öncesi çalışmaları hem de terapötik uygulamaları için genel bir husus olarak, hedef genin hedef hücre tipi için gerekli olduğu senaryolar atılmalıdır. ETR’ler tarafından empoze edilen temel bir genin tam, uzun süreli susturulması, zaman içinde hedef hücrelerin karşı seçimine (ve potansiyel olarak tedavinin toksisitesine) yol açacaktır. Bu durumlarda RNAi33 gibi kısmi hedef iptali sağlayan alternatif teknolojiler tercih edilir.

ETR’lerin hedef üzerindeki susturma aktivitesinin değerlendirilmesi
KRAB, DNMT3A ve DNMT3L efektör alanlarının kombinasyonuna dayanan ETR’lerin, transkripsiyon başlangıç bölgesi32’ye odaklanan geniş bir 1 kilobaz uzun izin veren hedefleme penceresi ile protein kodlayan genlerin büyük çoğunluğuna karşı etkili olduğu kanıtlanmıştır. İyi yapılmış bir epigenetik susturma deneyinin nasıl göründüğüne dair bir fikir edinmek için, K-562 hücrelerinde B2M geninin susturulmasının teknik detayları ve sonuçları burada verilmiştir. Bu, sadece K-562 hücreleri ile çalışan araştırmacılar tarafından değil, aynı zamanda ETR tabanlı teknolojiye ilk kez yaklaşanlar tarafından da dahil edilmesi gereken önemli bir pozitif kontrol olarak kabul edilebilir. Protokolde belirtildiği gibi, yapay nükleaz (örneğin, CRISPR / Cas9) tabanlı gen bozulması, hem ilgilenilen hücre tipinde gen iletiminin etkinliğinin hem de hedef genden yoksun hücrelerin fenotipinin ek bir kontrolü olarak önerilmektedir. CRISPR/dCas9 tabanlı ETR’lerle birleştirilecek gRNA’ların ilk taramasından sonra, test edilen gRNA’ların hiçbiri hedef geni kalıcı olarak susturamıyorsa, aşağıdaki sırayla düşünülmelidir: 1) iletilen gRNA’ların ve ETR’lerin miktarının arttırılması; 2) aralarında sinerjik etkiler arayan en iyi gRNA’ların test havuzları. Uzun süreli susturma hala sağlanamıyorsa, şunlar göz önünde bulundurulmalıdır: 3) epigenetik susturma talimatı vermek için daha uygun bölgeleri hedefleyebilecek ek gRNA’ların test edilmesi; 4) hedef kromatine gelişmiş bir bağlanma kapasitesine sahip olabilecek ZFP8 veya TALE9 tabanlı DBD platformlarına geçiş; 5) geçiciden kararlıya geçiş – örneğin, ETR’lerin viral vektör tabanlı ekspresyonunu entegre etmek (CRISPR / dCas9 teknolojisini benimserken gRNA veya dCas9 füzyon yapıları veya her ikisi). Grubumuz, üç ayrı ETR’nin30 birlikte dağıtımını geliştirdiğinden ve bu konuda sağlam bir deneyime sahip olduğundan, burada gösterilen protokol ve sonuçlar bu yaklaşıma dayanmaktadır. Bununla birlikte, benzer bir kavramsal iş akışı, hepsi bir arada CRISPR tabanlı bir sistemiçin uygulanabilir 32.

ETR’lerin hedef dışı aktivitesinin değerlendirilmesi
Çok sayıda çalışma, KRAB, DNMT3A ve DNMT3L efektör alanlarının30,31,32 kombinasyonuna dayalı olarak ETR’lerin özgüllüğünün ön in vitro göstergelerini göstermiştir. Bununla birlikte, test edilen gRNA’lar arasında hiçbiri transkripsiyonel regülasyon ve/veya de novo DNA metilasyonu açısından tatmin edici bir özgüllük profili göstermiyorsa, birbirini dışlamayan iki strateji izlenebilir: a) ETR’lerin hücre içinde kalma süresini (ve dolayısıyla potansiyel hedef dışı aktivitelerini) ETR’lerin dozlarını azaltarak veya alternatif dağıtım sistemlerini test ederek azaltmak. Örneğin, plazmitlerle karşılaştırıldığında, hem mRNA’nın hem de protein dağıtımının, ETR’lere hücre maruziyet süresini ve sonuç olarak hedef dışı aktivite olasılığını azaltması beklenir55; b) platform56’nın hedef dışı bağlanmasını azaltmak için optimize edilmiş daha yeni Cas9 varyantlarına veya alternatif ZFP8 veya TALE9 tabanlı DNA bağlanma teknolojilerine geçiş. Sahte muamele edilmiş örneklerle karşılaştırıldığında, gen susturmanın hedef ve hedef dışı aktivitesinin yalnızca DBD’nin hedef dizilerine bağlanmasından değil, aynı zamanda epigenetik efektör alanlarının doğal, endojen kofaktörleri tarafından diğer lokuslara alınma potansiyel kapasitesinden de etkilendiğini dikkate almak önemlidir. Bu nedenle, ETR’lerin hedef hücrede kalma süresinin azaltılması, yalnızca DBD’nin hedef dışı bölgelere bağlanma olasılığını değil, aynı zamanda ETR’lerin endojen kofaktörlerle etkileşime girme olasılığını da azaltabilir. Son olarak, sahte muamele edilmiş örneklerle karşılaştırıldığında, susturulmuş hücrelerde ölçülen transkripsiyonel ve daha az olası CpG metilasyon değişikliklerinin bir kısmı, hedef genin yoksunluğu ile basitçe türetilebilir. Bunlar susturma teknolojisinin hedef dışı olarak kabul edilmez. Bunları tanımlamak için, deney paneline yapay nükleaz ile gen bozulmasıda dahil edilmelidir 8,9,10. Hedef genin fonksiyonel kaybına bağlı biyolojik değişiklikler, epigenetik susturma ile bu alternatif teknoloji arasında paylaşılacaktır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica ve Deborah Cipria’ya yıllar boyunca epigenetik susturma teknolojisini geliştirmeye yönelik ortak çabaları için teşekkür etmek istiyor; Dejan Lazarevic ve Francesca Giannese, protokolde açıklanan RNA-seq ve MeDIP-seq analizlerinin eleştirel incelemesi için. Bu çalışma, Telethon Vakfı’ndan (TIGET hibe no. F1) ve AB Horizon 2020 Programından (UPGRADE) A.L.’ye verilen hibelerle desteklenmiştir. İllüstrasyonlar BioRender.com ile oluşturulmuştur.

YAZARLARIN KATKISI
A.M., M.A.C., F.G. ve A.C. protokolün tasarlanmasına ve makalenin yazılmasına katkıda bulundular; S.V., I.M. ve D.C. protokolün biyoinformatik bölümlerini tasarladı ve makaleyi revize etti; A.M. ve A.L. protokolü tasarladılar, tüm yazarların katkılarıyla makaleyi tasarladılar ve yazdılar.

Materials

4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc
cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc
cccccccccccctctccctcccccccccctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaggccg
gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct
ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg
tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac
cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt
cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg
cgagggcgagggccgcccctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg
cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag
cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa
ggacggcggccactacctggtggagttcaag
accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactactacgtggacaccaagctg
gacatcacctcccacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg
ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc
ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgagggcgagggccgcccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac
caagggcggccccctgcccttcgcctgggac
atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa
ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac
ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg
ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc
cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggcca
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctactact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgaggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc
tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct
ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctggggggtggggtggggcag
gacagcaagggggaggattgggaagacaat
agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat
ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa
tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag
aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat
ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O’leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137 (2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington’s disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -. S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Tags

Epigenetic SilencingGene SilencingArtificial NucleasesEngineered Transcriptional RepressorsChromatin CompactionTranscriptional InhibitionGene DisruptionRNA InterferenceB2M GeneCRISPR Cas9Nucleofection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image