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Bioengineering

In vitro Selezione di repressori trascrizionali ingegnerizzati per il silenziamento epigenetico mirato

Published: May 05, 2023
doi:
10.3791/64403
, , , , , , ,
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget),IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences,IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies,National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per la selezione in vitro di repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) con un’efficienza di silenziamento alta, a lungo termine, stabile, on-target e bassa attività a livello di genoma, off-target. Questo flusso di lavoro consente di ridurre un repertorio iniziale e complesso di ETR candidati a un breve elenco, adatto per un’ulteriore valutazione in contesti terapeuticamente rilevanti.

Abstract

L’inattivazione genica è fondamentale per studiare la funzione genica e rappresenta una strategia promettente per il trattamento di un’ampia gamma di malattie. Tra le tecnologie tradizionali, l’interferenza dell’RNA soffre dell’abrogazione parziale del bersaglio e della necessità di trattamenti per tutta la vita. Al contrario, le nucleasi artificiali possono imporre un’inattivazione genica stabile attraverso l’induzione di una rottura del doppio filamento di DNA (DSB), ma studi recenti stanno mettendo in discussione la sicurezza di questo approccio. L’editing epigenetico mirato tramite repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR) può rappresentare una soluzione, poiché una singola somministrazione di specifiche combinazioni di ETR può portare a un silenziamento duraturo senza indurre rotture del DNA.

Gli ETR sono proteine contenenti un dominio di legame al DNA programmabile (DBD) ed effettori di repressori trascrizionali presenti in natura. In particolare, è stato dimostrato che una combinazione di tre ETR equipaggiati con il dominio KRAB di ZNF10 umano, il dominio catalitico di DNMT3A umano e DNMT3L umano, induce stati epigenetici repressivi ereditabili sul gene bersaglio di ETR. La natura mordi e fuggi di questa piattaforma, la mancanza di impatto sulla sequenza del DNA del bersaglio e la possibilità di tornare allo stato repressivo mediante demetilazione del DNA su richiesta, rendono il silenziamento epigenetico uno strumento rivoluzionario. Un passo fondamentale è l’identificazione della corretta posizione degli ETR sul gene bersaglio per massimizzare il silenziamento on-target e ridurre al minimo il silenziamento off-target. L’esecuzione di questa fase nel setting preclinico finale ex vivo o in vivo può essere ingombrante.

Prendendo il sistema CRISPR/cataliticamente morto Cas9 come DBD paradigmatico per gli ETR, questo articolo descrive un protocollo costituito dallo screening in vitro di RNA guida (gRNA) accoppiato alla combinazione triplo ETR per un efficiente silenziamento sul bersaglio, seguito dalla valutazione del profilo di specificità a livello di genoma dei migliori successi. Ciò consente di ridurre il repertorio iniziale di gRNA candidati a una breve lista di gRNA promettenti, la cui complessità è adatta per la loro valutazione finale nel contesto terapeuticamente rilevante di interesse.

Introduction

L’inattivazione genica ha tradizionalmente svolto un ruolo chiave nello studio della funzione genica sia in modelli cellulari che animali. Inoltre, negli ultimi due decenni, con l’ascesa della terapia genica, è stata proposta come un approccio potenzialmente rivoluzionario per il trattamento di malattie causate da mutazioni con guadagno di funzione1, malattie infettive2 o patologie in cui il silenziamento di un gene può compensare un difetto ereditario in un altro3. Infine, è stata proposta l’inattivazione genetica di regolatori chiave della fitness cellulare e del controllo funzionale per migliorare l’efficienza dei prodotti cellulari per l’immunoterapia del cancro4 e la medicina rigenerativa5.

Tra le diverse tecnologie per realizzare l’inattivazione genica, una delle più promettenti è il silenziamento epigenetico mirato 6,7. Al centro di questa tecnologia ci sono i cosiddetti repressori trascrizionali ingegnerizzati (ETR), proteine chimeriche costituite da un dominio programmabile di legame al DNA (DBD) e da un dominio effettore (ED) con funzione repressiva epigenetica. Le proteine a dita di zinco (ZFP)8, gli effettori simili agli attivatori di trascrizione (TALE)9 o i DBD basati su CRISPR/dCas910 possono essere progettati per legare selettivamente l’ED alla sequenza promotore/potenziatore del gene bersaglio da silenziare. Una volta lì, l’ED dell’ETR svolge la sua attività di silenziamento imponendo segni epigenetici repressivi che inducono l’eterocromatina come le modificazioni istoniche (metilazione H3K911,12 o H3K27 13, deacetilazioneH3 o H414) e la metilazione del DNACpG 15, a seconda del dominio repressivo utilizzato.

In particolare, ispirandosi ai processi molecolari di repressione trascrizionale permanente di retrovirus endogeni che avvengono nell’embrionepreimpianto 16, è stata generata una combinazione di tre ETR per sfruttare i seguenti ED: i) il dominio box associato a Krüppel (KRAB) di ZNF10 umano; ii) il dominio catalitico della DNA metiltransferasi 3A umana de novo (DNMT3A); e iii) la DNA metiltransferasi umana 3-like (DNMT3L) a lunghezza intera. KRAB è un dominio repressivo conservato condiviso da diversi ZFP nei vertebrati superiori17,18, la cui attività di silenziamento si basa principalmente sulla sua capacità di reclutare KAP1 19-una proteina scaffold che poi interagisce con diversi altri induttori dell’eterocromatina 20-comprendente il complesso di rimodellamento e deacetilazione dei nucleosomi (NuRD) 21, l’istone metiltransferasi H3K9 SETDB122 e il lettore di metilazione H3K9 HP1 23, 24, tra gli altri.

DNMT3A trasferisce attivamente i gruppi metilici sul DNA alle sequenze CpG25. L’attività catalitica di DNMT3A è potenziata dalla sua associazione fisica con DNMT3L, un paralogo di DNMT3A ristretto da embrioni e cellule germinali privo del dominio catalitico responsabile del trasferimento del gruppo metilico26,27. La metilazione del DNA nelle regioni ricche di CpG, denominate isole CpG (CGI), incorporate negli elementi promotori/potenziatori dei geni dei mammiferi è solitamente associata al silenziamento della trascrizione28. È importante sottolineare che, una volta depositata, la metilazione di CpG può essere ereditata stabilmente durante la mitosi da un complesso molecolare basato su UHRF1-DNMT129.

La sovraespressione stabile degli ETR nella cellula bersaglio può essere problematica, probabilmente a causa dei crescenti rischi di attività off-target e di squelching degli interattori endogeni dai loro siti bersaglio fisiologici nel tempo. Tuttavia, l’espressione transitoria di singole porzioni ETR può non riuscire a indurre un silenziamento a lungo termine con alta efficienza30, ostacolando la loro applicazione terapeutica. Pertanto, una svolta fondamentale nel campo è stata l’evidenza che la combinazione dei tre ETR basati su KRAB, DNMT3A e DNMT3L può sinergizzare e, anche quando solo transitoriamente co-somministrati, imporre alla sequenza del promotore del gene bersaglio H3K9 e la metilazione di CpG. Questi vengono poi letti e propagati dalla cellula durante la mitosi, portando al silenziamento ereditabile in più linee cellulari umane e murine, nonché in cellule primarie coltivate ex vivo 30.

Da notare che il silenziamento epigenetico imposto dagli ETR può essere invertito su richiesta mediante demetilazione mirata (ad esempio, il reclutamento della DNA demetilasi TET1 basata su CRISPR/dCas9 sul locus silenziato) o farmacologica (somministrazione dell’inibitore della DNA metiltransferasi 5-Aza)30, un potenziale antidoto in caso di eventi avversi correlati all’ETR. Sono stati descritti anche ETR all-in-one con i tre ED basati su KRAB, DNMT3A e DNMT3L, che mostrano significative efficienze di silenziamento nelle linee cellulari31,32 contro la grande maggioranza dei geni codificanti proteine. Inoltre, diversi studi che impiegano gli ETR hanno riportato un elevato profilo di sicurezza, senza alcuna importante attività off-target in termini di metilazione de novo di CpG o alterazione dell’accessibilità della cromatina30,31,32. Tuttavia, prima delle applicazioni cliniche si raccomanda un’analisi dedicata del profilo di specificità degli ETR dotati di DBD di nuova concezione.

Da un punto di vista clinico, il silenziamento epigenetico mirato può fornire vantaggi critici sia per il knockdown basato sull’interferenza dell’RNA (RNAi)33 che per la distruzione genica basata sulla nucleasiartificiale 8. A differenza dell’RNAi, il silenziamento epigenetico mirato può indurre l’abrogazione completa del suo bersaglio per cellula e non richiede un trattamento periodico per garantire il silenziamento a lungo termine; a differenza della distruzione genica, lascia inalterata la sequenza del DNA, evitando la generazione di rotture a doppio filamento di DNA (DSB). I DSB possono quindi indurre l’apoptosi e l’arresto del ciclo cellulare, portando potenzialmente a una selezione contro cellule con una via funzionale di p53 34,35 e, specialmente in contesti di editing genetico multiplex, riarrangiamenti cromosomici35. Inoltre, trasmettendo l’esito irreversibile del mosaico della riparazione DSB del DNA mediata da un’estremità non omologa36, la distruzione genica non può evitare la riparazione in-frame del bersaglio in sequenze codificanti funzionali come uno dei risultati finali e, a differenza del silenziamento epigenetico, non può essere cancellata su richiesta.

Infine, il silenziamento epigenetico ha il potenziale per ampliare la gamma di elementi genetici bersaglio a classi completamente o almeno parzialmente refrattarie all’RNAi e alla distruzione genica, come gli elementi regolatori non trascritti e gli RNA non codificanti30,32. Il primo passo critico per qualsiasi applicazione mirata di silenziamento epigenetico è quello di progettare un pannello di ETR che copra le diverse sequenze regolatorie del gene bersaglio e identificare quelle più performanti. Il numero di ETR da testare può essere cruciale, considerando la crescente porzione di genoma che può essere presa di mira dalle tecnologie programmabili di legame del DNA costantemente in fase di sviluppo37. L’esecuzione dello screening degli ETR direttamente sul tipo di cellula in cui silenziare terapeuticamente il gene bersaglio rappresenterebbe l’opzione più rilevante. Tuttavia, gli screening ad alto rendimento possono essere tecnicamente ingombranti nelle cellule primarie a causa della loro limitata sopravvivenza in coltura e della loro capacità ingegneristica spesso non ottimale. Gli schermi su larga scala possono essere ancora più irrealizzabili in vivo.

Un’alternativa più pratica consiste nell’eseguire uno screening iniziale di un ampio pannello di ETR in linee cellulari facilmente ingegnerizzabili in un primo momento, e poi convalidare solo quelle più promettenti nel tipo di cellula terapeuticamente rilevante. Un problema parallelo è la selezione di una lettura appropriata per misurare l’efficienza di silenziamento degli ETR. La valutazione diretta del trascritto o dei livelli proteici del gene bersaglio mediante RT-qPCR, western blot o ELISA può essere costosa e dispendiosa in termini di tempo e può non avere una sensibilità sufficiente, limitandone così l’applicazione su scale ad alto rendimento. La generazione di linee cellulari reporter ingegnerizzate ad hoc in cui un fluoroforo è posto sotto il controllo trascrizionale delle sequenze regolatorie del gene bersaglio consente di sfruttare l’approccio basato sulla citometria a flusso per leggere il silenziamento epigenetico a livello di singola cellula e ad alto ritmo di throughput.

Seguendo queste considerazioni generali, questo articolo descrive un protocollo che consiste nello screening in vitro di ETR per l’efficienza di silenziamento on-target, seguito dalla valutazione dell’attività off-target a livello di genoma dei migliori hit. Questo flusso di lavoro consente di ridurre il repertorio iniziale di ETR candidati a una breve lista di ETR promettenti, la cui complessità è adatta per la loro valutazione finale nel tipo di cellula di interesse terapeuticamente rilevante.

Tra i diversi DBD programmabili che possono essere sfruttati per generare ETR, questo protocollo si concentrerà sulla tecnologia basata su CRISPR/dCas9, a causa della facilità di progettazione di gRNA che coprono il promotore del gene bersaglio su una scala ad alto rendimento. Tuttavia, lo stesso flusso di lavoro concettuale descritto di seguito può essere adottato per valutare l’efficienza e la specificità degli ETR equipaggiati con altri DBD.

Protocol

1. Ingegnerizzazione di una linea cellulare reporter basata sulla fluorescenza per monitorare l’attività trascrizionale del gene bersaglio mediante citometria a flusso Identificare le linee cellulari che esprimono il gene bersaglio da silenziare. Sfoglia il gene bersaglio da silenziare nell’Atlante delle proteine umane38 e naviga attraverso la sua sezione “Linea cellulare” per identificare quelle linee rappresentative del tessuto somatico di interesse (ad esempio, una linea cellulare epatica se i bersagli finali sono epatociti epatici). In alternativa, interrogare un database di sequenziamento dell’RNA (RNA-Seq) disponibile al pubblico (ad esempio, NCBI GEO). Tra i candidati, dare priorità alle linee cellulari per le quali sono disponibili efficienti protocolli di rilascio genico transitorio, strumentali per il rilascio di ETR.NOTA: Tra le diverse modalità, la nucleofezione rappresenta una delle migliori opzioni, in quanto garantisce elevate efficienze di trasfezione. Qui, le cellule umane di eritroleucemia K-562 sono state scelte per generare una linea cellulare che riporta l’attività trascrizionale del gene beta-2-microglobulina (B2M) (di seguito denominato cellule B2MTdTomato K-562). Dare inoltre la priorità ai candidati per evitare linee cellulari in cui il gene bersaglio è essenziale per la vitalità cellulare, in quanto ciò compromette il mantenimento delle cellule con silenziamento stabile del gene bersaglio in coltura. Se non riportato in precedenza, per avere un’idea dell’essenzialità del gene bersaglio nel tipo di cellula di scelta, generare un controllo di disgregazione genetica trasfettando le cellule con nucleasi Cas9 e un gRNA mirato a uno dei primi esoni codificanti del gene.NOTA: L’alterazione genetica è un evento stabile per definizione; La controselezione delle cellule interrotte nel tempo indica che il gene bersaglio è essenziale per la fisiologia della cellula selezionata.Identificare l’isoforma di splicing target utilizzata preferenzialmente nella linea cellulare selezionata (l’isoforma NM_004048.4 del gene B2M è bersaglio in questo protocollo). Identificare un gRNA in grado di tagliare in modo efficace e specifico nel primo esone codificante dell’isoforma bersaglio (ad esempio, Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, che è uno strumento di selezione del gRNA online valido e facile da usare). Per le cellule K-562, trasfettare 1 μg di plasmide codificante per sp Cas9 (hCas9; vedere Tabella dei materiali) e 250 ng di plasmide codificanteper gRNA (phU6-gRNA; vedere Tabella dei materiali) per 5 × 105 cellule attraverso la nucleofezione (secondo le istruzioni del produttore). Coltivare le cellule (cellule K-562 a 37 °C sotto il 5% di CO2 in RPMI-1640 integrate con il 10% di siero fetale bovino [FBS], L-glutammina e penicillina/streptomicina [100 U/mL]) e monitorare i livelli di alterazione genica nel tempo sfruttando un kit di rilevamento delle mutazioni (seguire le istruzioni del produttore). Clone di un modello donatore per l’integrazione mediata dalla ricombinazione omologa di un reporter fluorescente sotto il controllo trascrizionale del gene bersaglio di interesse (Figura 1).Identificare la regione del gene bersaglio per integrare la cassetta di espressione dei fluorofori.NOTA: Evitare di prendere di mira elementi trascrizionalmente rilevanti, come le isole e le regioni CpG arricchite per l’acetilazione di H3K27 (marcatore di promotori e potenziatori attivi). L’alterazione di questi elementi regolatori (potenzialmente importante per essere bersagliati dagli ETR per istruire il silenziamento epigenetico) rende la linea cellulare reporter meno predittiva della regolazione fisiologica del gene bersaglio.Se il gene bersaglio non codifica per una proteina secreta, fondere il reporter con l’ultimo codone del gene bersaglio attraverso un peptide auto-scissivo 2A per mantenere la funzionalità del gene bersaglio. Se il gene bersaglio codifica per una proteina secreta, per evitare la potenziale secrezione del reporter, posizionare il reporter in una regione intronica del gene bersaglio. L’integrazione forzata del reporter nel trascritto di splicing attraverso un sito accettore di splicing (SA) e la successiva traduzione attraverso una sequenza di ingresso del ribosoma interno (IRES) compromettono la funzionalità del gene bersaglio. Utilizzare Chopchop per selezionare il taglio dell’gRNA nella regione bersaglio (in questo caso, viene selezionato un gRNA per colpire la sequenza 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ del primo introne del gene B2M ). Progettare un modello donatore per il sito di taglio del gRNA costituito da: i) un braccio di omologia sinistra (n coppie di basi [bp] corrispondenti alla regione appena a monte del sito di taglio del gRNA); ii) una cassetta di espressione transgenica priva di promotore (nel caso qui mostrato, una poli(A) SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH che favorisce lo splicing con il primo introne del gene B2M ); e iii) un braccio di omologia destra (n bp corrispondente alla regione a valle del sito di taglio del gRNA).NOTA: La lunghezza dei bracci di omologia necessari per indurre efficacemente la ricombinazione omologa può variare tra i diversi tipi di cellule (100-500 bp è un intervallo appropriato per le cellule K-562). Somministrare il sistema di nucleasi CRISPR/Cas9 e il modello del donatore all’interno della linea cellulare bersaglio. Per le cellule K-562, trasfettare 1 μg di plasmide codificante per sp Cas9 (hCas9; vedere Tabella dei materiali), 250 ng di plasmide codificante per gRNA (phU6-gRNA; vedere Tabella dei materiali) e 1 μg di plasmide codificanteper modello del donatore per 5 × 105 cellule attraverso la nucleofezione (secondo le istruzioni del produttore). Coltivare le cellule per almeno 14 giorni (per le cellule K-562) e monitorare i livelli di espressione del reporter fluorescente nel tempo utilizzando un citometro a flusso (attivare il canale della ficoeritrina (PE) per misurare l’intensità della fluorescenza del reporter tdTomato e seguire le istruzioni del produttore per eseguire la citometria a flusso).NOTA: Il modello del donatore, specialmente se basato su plasmidi, può contenere sequenze criptiche del promotore, che portano all’espressione del reporter fluorescente da copie del donatore non integrate. La coltura delle cellule consente la diluizione di queste copie non integrate mediante divisione cellulare e, infine, il mantenimento dell’espressione del reporter solo dalle copie del donatore integrate nel genoma bersaglio. Clone di cellule reporter-positive attraverso la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) a livello di singola cellula. Per questo protocollo, attivare il canale PE per misurare l’intensità di fluorescenza del reporter tdTomato e seguire le istruzioni del produttore per ordinare le singole cellule K-562 tdTomato-positive per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Dopo l’espansione cellulare in coltura (in genere 20-30 giorni per le cellule K-562), eseguire lo screening dei cloni reporter-positivi mediante PCR per selezionarne uno che porta un’integrazione bi-allelica della cassetta reporter all’interno del locus bersaglio.NOTA: Questo massimizza l’espressione del reporter e facilita l’ulteriore risoluzione tra le cellule che esprimono reporter e le cellule che silenziano il reporter mediante citometria a flusso dopo il trattamento con ETR.Estrarre il DNA genomico da 1 × 105 cellule per clone reporter-positivo utilizzando un kit di estrazione del DNA (seguendo le istruzioni del produttore). Amplificare la regione target B2M con primer diretti (5′-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3′) e inversi (5′-AATGGTTGAGTTGGAC-3′) seguendo le istruzioni del kit di amplificazione PCR. La temperatura di ricottura per questa coppia di primer è di 47,7 °C con DNA polimerasi a base di Taq e concentrazioni di primer di 0,5 μM. Analizzare il prodotto PCR utilizzando l’elettroforesi su gel di agarosio all’1% (seguendo le istruzioni del produttore). Screening per cloni che mostra la banda correlata all’integrazione del tdTomato nel locus bersaglio B2M (3.413 bp), senza la banda correlata al locus bersaglio wild-type (1.027 bp). 2. Progettazione di gRNA per il silenziamento epigenetico del gene bersaglio basato su CRISPR/dCas 9 Sfoglia il gene bersaglio nel browser del genomaUCSC 40 ed estrai la sequenza nucleotidica delle regioni che potenzialmente regolano la sua attività trascrizionale, come le isole CpG e i siti arricchiti per l’acetilazione di H3K27 (marcatore di promotori e enhancer attivi).NOTA: Secondo uno studio recente, la migliore regione di targeting è una finestra di 1 kilobase (kb) centrata sul sito di inizio della trascrizione del genebersaglio 32. Incolla le sequenze selezionate nello strumento online Chopchop e seleziona la repressione come scopo dei gRNA da recuperare. Attendere che Chopchop fornisca un elenco di gRNA mappati sulla sequenza genetica di interesse ed elencati in base a un punteggio che consideri sia il numero di corrispondenze fuori bersaglio che l’efficienza prevista sul bersaglio (Figura 2). Selezionare almeno 10 gRNA per sequenza bersaglio. Se possibile, cercare di selezionare gRNA che si estendono in tutta la regione da interrogare, senza corrispondenze complete con altre sequenze intrageniche in tutto il genoma. 3. Rilascio transiente arrayed di ETR basati su CRISPR/dCas 9 nella linea cellulare reporter Tra i sistemi di rilascio di transgeni precedentemente descritti per la linea cellulare bersaglio, scegliere quelli che consentono solo l’espressione transgenica transitoria, massimizzando l’efficienza di rilascio e riducendo al minimo la tossicità correlata alla manipolazione cellulare. Nel caso delle cellule K-562, sia la nucleofezione del plasmide che quella dell’mRNA sono altamente raccomandate, con la produzione di plasmidi che rappresenta un’alternativa tecnicamente più semplice ed economica. Clonare sia i gRNA selezionati nella sezione 2 che gli ETR basati su CRISPR/dCas9 nel sistema di rilascio del transgene di scelta. Vedere i seguenti passaggi per un protocollo per la clonazione degli ETR nei DNA plasmidici.NOTA: I plasmidi che codificano separatamente per dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A e dCas9:DNMT3L30 non sono disponibili su Addgene. Sono stati clonati sostituendo il trans-attivatore VP160 dal plasmide pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (vedi Tabella dei materiali) con la sequenza codificante del dominio KRAB, DNMT3A o DNMT3L30. È disponibile una codifica plasmidica per un ETR all-in-one, denominato CRISPRoff-v2.132 (vedere la tabella dei materiali).Trasformare i plasmidi che codificano per gli ETR in cellule di E. coli chimicamente competenti (seguendo le istruzioni del produttore). Eseguire lo screening delle colonie per la presenza del plasmide portatore di ETR mediante digestione dell’enzima di restrizione e sequenziamento di Sanger, e infine scegliere una delle colonie positive per la produzione di DNA plasmidico Midiprep (seguendo le istruzioni del produttore). Clonare i gRNA all’interno della spina dorsale del phU6-gRNA (Figura 3).Utilizzando un software di progettazione di biologia molecolare, aggiungere una sequenza 5′-CACCG-3′ a monte del protospacer (la prima variabile 20 nucleotidi [nt] del gRNA selezionato) per generare un oligo lungo 25 nt in silico, indicato come SGfw. Allo stesso modo, aggiungere una sequenza 5′-AAAC-3′ a monte del complemento inverso del protospacer del gRNA selezionato e una sequenza 5′-C-3′ a valle di esso per generare un oligo lungo 25 nt indicato come SGrv. Ordina entrambe le sequenze SGfw e SGrv come oligo di DNA a singolo filamento privi di sale, risospesi in acqua a 100 μM. Aggiungere 1 μL di ciascun oligo a 2 μL di tampone di ricottura (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) e 16 μL di acqua. Eseguire l’oligoricottura ponendo la soluzione in un termociclatore programmato per iniziare a 95 °C per 10 min. Quindi, raffreddare gradualmente a 25 °C per 45 minuti. Diluire 1 μL degli oligo ricotto con 99 μL di acqua priva di nucleasi, quindi legare 1 μL di questa diluizione con 50 ng di plasmide phU6-gRNA precedentemente digerito con l’enzima di restrizione BsaI (seguire le istruzioni dei fornitori di kit BsaI e ligasi per la procedura di digestione e legatura). Trasformare 20 μL di cellule di E. coli chimicamente competenti con 2 μL del prodotto di legatura (seguire le istruzioni del produttore per la procedura di trasformazione). Scegliere più colonie per la produzione di DNA plasmidico Miniprep (seguire le istruzioni del fornitore) e controllare il successo del clonaggio del protospacer mediante sequenziamento Sanger con il seguente primer corrispondente al promotore U6 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3′. Scegliere una delle colonie positive per la produzione di DNA plasmidico Midiprep (seguendo le istruzioni del produttore). Fornire i gRNA selezionati e gli ETR basati su CRISPR/dCas9 nella linea cellulare reporter in array (un gRNA specifico per condizione) (Figura 3).NOTA: Come caso rappresentativo, il flusso di lavoro per la nucleofezione di plasmidi che codificano per dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L e gRNA che mirano all’isola B2M CpG nelle cellule B2M TdTomato K-562 è mostrato nei passaggi seguenti.Preparare provette separate contenenti 500 ng di ciascuno dei plasmidi codificanti dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- e dCas9:DNMT3L, ma diverse per il gRNA da testare (125 ng di un plasmide codificante gRNA per provetta). Includere una condizione di nucleofezione priva di gRNA ed ETR come campione trattato con simulazione. Eseguire lo screening con almeno tre repliche tecniche per campione. Pellet 5 × 105 celluleB2M TdTomato K-562 per provetta e nucleofectarle con la miscela plasmidica (seguendo le istruzioni del produttore). Risospendere le cellule in 200 μL di terreno di coltura cellulare di mammifero RPMI-1640 precedentemente riscaldato e riposizionarle nell’incubatrice. 4. Analisi dell’attività trascrizionale del gene bersaglio nel tempo Utilizzare la citometria a flusso per misurare la percentuale di cellule silenziate in diversi momenti dopo la consegna degli ETR (Figura 4). Utilizzare le cellule wild-type (WT), che non portano la sequenza di codifica per fluorofori, per impostare la soglia delle cellule reporter-negative. Utilizzare il campione trattato in modo simulato per impostare il gate per le celle positive al reporter.NOTA: Come suggerito al punto 1.3, includere un controllo dell’interruzione genetica nell’esperimento. Questo può essere utile sia per monitorare l’efficienza di rilascio di CRISPR che la fitness delle cellule private del gene bersaglio; La perdita sia del silenziamento trascrizionale che della distruzione genetica nel tempo può essere attribuita all’essenzialità del gene bersaglio nel tipo di cellula di scelta. Includi sia i punti temporali a breve (giorno 3, giorno 7, giorno 10) che quelli a lungo termine (giorno 21, giorno 35) per ottenere un’indicazione dell’efficienza acuta e a lungo termine del silenziamento. Identificare i primi tre gRNA in termini di efficienza di silenziamento a lungo termine. Utilizzare FACS per selezionare la sottopopolazione reporter-negativa mantenuta stabilmente in tali campioni. Inoltre, eseguire il FACS dei campioni sfusi trattati in modo simulato per mantenerli sottoposti allo stesso trattamento dei campioni di prova per consentire un corretto confronto nelle analisi successive. 5. Valutazione della specificità del trattamento ETR mediante RNA-seq e immunoprecipitazione del DNA metilato (MeDIP)-seq Utilizzare RNA-seq per valutare qualsiasi eventuale deregolazione trascrizionale dell’intero genoma al momento della somministrazione di ETR.Sia per la sottopopolazione dei campioni trattati con i tre gRNA ad alte prestazioni che per le cellule trattate con simulazione, estrarre l’RNA utilizzando kit disponibili in commercio. Valutare la qualità e la concentrazione dell’RNA utilizzando kit disponibili in commercio. Eseguire la frammentazione dell’RNA, la retrotrascrizione e la preparazione della libreria utilizzando i kit disponibili in commercio per la preparazione delle librerie RNA-seq (seguendo le istruzioni del produttore). Esegui la quantificazione della libreria e il controllo qualità utilizzando strumenti di controllo qualità compatibili con il sequenziamento di nuova generazione e l’elettroforesi digitale. Librerie di sequenze su un sequencer di nuova generazione seguendo le istruzioni del produttore, con un protocollo paired-end da 100 bp e puntando a una media di 45 M letture/campione. Allinea i tag di lettura al genoma di riferimento appropriato e quantifica l’espressione della trascrizione. Eseguire l’allineamento sulla sequenza tdTomato e quantificarla separatamente.NOTA: In questo caso, viene utilizzato l’allineatore STAR (v 2.3.0)43, con parametri predefiniti, accoppiato al pacchetto Rsubread44. Eseguire l’analisi dei dati RNA-seq secondo le migliori pratiche pubblicate45.NOTA: In questo caso viene utilizzato il pacchetto R/Bioconductor edgeR46, applicando un filtro di almeno un conteggio per milione (cpm) in almeno tre campioni per scartare i geni a bassa espressione. In alternativa, è possibile usare la funzione filterByExpr in edgeR. Valutare l’espressione genica differenziale utilizzando un modello log-lineare generalizzato binomiale negativo implementato edgeR (funzione glmFit)47. Impostare una soglia di 0,01 sui valori p aggiustati (correzione di Benjamini-Hochberg [BH]) per mantenere i geni regolati in modo differenziale. Valutare l’eventuale attività di metilazione di CpG off-target degli ETR mediante MeDIP-seq.Sia per la sottopopolazione dei campioni trattati con i primi tre gRNA che per le cellule trattate con simulazione, estrarre il DNA genomico utilizzando i kit disponibili in commercio (seguendo le istruzioni dei produttori). Sonicare 500 ng di DNA genomico utilizzando un ultrasuonatore e i seguenti parametri: Dazio: 20 %; PIP: 175; Cicli per raffica: 200; Tempo: 40 s. Preparare le librerie di sequenziamento con i kit disponibili in commercio per MeDIP-seq (seguendo le istruzioni del produttore). Dopo la fase di legatura dell’adattatore, quantificare le librerie mediante saggio fluorimetrico e verificare l’efficienza di legatura mediante qPCR utilizzando i kit di quantificazione della libreria disponibili in commercio (seguendo le istruzioni del produttore). Ottieni pool di librerie mescolando librerie selezionate in modo casuale per ridurre le distorsioni tecniche. Utilizza una quantità di libreria uguale (ng) per ogni libreria per bilanciare i pool. A ciascun pool, aggiungere il DNA di controllo spike-in metilato e non metilato fornito nel kit. A scopo di controllo, mantenere un volume del 10% della libreria, etichettato come “input” e non immunoprecipitato. Eseguire l’immunoprecipitazione sul restante 90% della libreria utilizzando l’anticorpo monoclonale diretto contro la 5-metilcitosina fornita nel kit MeDIP-seq. Purificare le librerie arricchite e in ingresso utilizzando i kit per la purificazione del prodotto di immunoprecipitazione della 5-metilcitosina, seguendo le istruzioni dei produttori. Valutare l’efficienza dell’arricchimento eseguendo la PCR quantitativa in tempo reale sul picco interno nei controlli utilizzando i primer forniti con il kit. Per ogni immunoprecipitazione (IP), calcolare la specificità di arricchimento dal recupero di DNA metilato e non metilato, utilizzando i valori di soglia del ciclo (Ct) di MeDIP e le frazioni di input ottenute dalla reazione qPCR (vedi equazioni 1 e 2): (1) (2)NOTA: considerare le librerie IP riuscite se i valori di specificità sono ≥0,95. Amplifica le librerie utilizzando i kit di preparazione delle librerie MeDIP-seq, seguendo le istruzioni dei produttori, ed esegui la quantificazione e l’analisi della distribuzione delle dimensioni della libreria del prodotto. Eseguire il sequenziamento della libreria sui sequencer di nuova generazione. Utilizzare il sequenziamento paired-end, con una lunghezza di lettura di 100 bp, con l’obiettivo di una media di 30 M letture/campione. Allineare i tag di lettura del sequenziamento al genoma di riferimento appropriato (ad esempio, hg38) utilizzando bwa (v 0.7.5 o superiore)48 e quindi identificare i picchi utilizzando MACS (v 2.0.10 o superiore)49, consentendo l’identificazione di picchi ampi (-slocal = 0,-llocal = 500000). Crea un set comune di regioni da campioni diversi utilizzando lo strumento di multiintersezione50 di BEDTools, abilitando l’opzione di clustering. Calcola la copertura per campione nell’elenco finale delle regioni utilizzando il multicov di BEDTools, scartando le letture duplicate. Eseguire l’analisi del conteggio della matrice utilizzando edgeR. Applicare un filtro di almeno un conteggio per milione (cpm) in almeno tre campioni per scartare le regioni a basso arricchimento.NOTA: In alternativa, è possibile utilizzare la funzione filterByExpr in edgeR. Identificare la metilazione differenziale adottando il modello log-lineare generalizzato implementato in edgeR (funzione glmFit) e normalizzando utilizzando la normalizzazione quantilica condizionale51 per correggere il contenuto di GC per regione. Selezionare le regioni differenzialmente metilate applicando una soglia di 0,01 sui valori di p aggiustati per BH. Eseguire l’analisi delle sequenze ripetute come segue.NOTA: Fare riferimento alla guida per l’utente di edgeR per l’elenco completo delle opzioni e dei parametri (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).Filtrare i risultati MeDIP-seq per un valore p nominale 1 nel primo set e le regioni con logFC <-1 nel secondo set. Recupera l’annotazione RepeatMasker per il genoma scelto come file bed e conta il numero di elementi in ogni set. Convertire il conteggio come rapporto sul numero di aree per ogni set di dati. Estrarre il rapporto di metiloma che si sovrappone a ciascuna classe di ripetizioni ed eseguire un test del chi-quadrato per rilevare qualsiasi arricchimento significativo. Valutare se le regioni trascritte in modo differenziale o metilate in modo differenziale tra i campioni trattati con ETR e mock sono mappate al legame dell’gRNA off-target previsto in silico.Usa la suite di progettazione CRISPR52 come strumento di previsione del legame del gRNA fuori bersaglio. Per ogni regione putativa fuori bersaglio, guarda il sito di inizio della trascrizione (TSS) più vicino e la regione metilata più vicina. Si consideri come vero effetto off-target una regione associata a un gene regolato con FDR <0,01 e una distanza da TSS inferiore a 10 Kb, o una regione metilata regolata con FDR <0,01 e una distanza inferiore a 1 Kb. Identificare il numero e le caratteristiche delle regioni trascrizionalmente alterate o sovrametilate nei campioni trattati con ciascuno dei tre gRNA più performanti rispetto ai campioni trattati con mock (Figura 5) per identificare il più specifico tra i gRNA. Classificare il potenziale impatto di un sito esterno alla fisiologia delle cellule bersaglio nel seguente ordine (dal più impattante al meno impattante):i) Gene intragenico, regolatorio-fisiologicamente espressoii) Gene intragenico, espresso fisiologicamente nella regione esonica,iii) Gene intragenico, fisiologicamente espresso nella regione intronicaiv) Gene intragenico, non espresso nella regione regolatoriav) Gene intragenico, non espresso nella regione esonica,vi) Gene intragenico, non espresso nella regione intronicavii) Regione intergenica

Representative Results

Al momento della consegna di un modello del donatore per l’integrazione mediata dalla ricombinazione omologa del reporter fluorescente nel locus bersaglio accoppiato con il sistema CRISPR/Cas9 (ad esempio, mediante nucleofezione plasmidica nel caso di cellule K-562), le cellule reporter-positive appaiono nel campione trattato (Figura 1, in basso). Se ciò non si verifica, ricontrollare l’accuratezza della progettazione e della clonazione sia del modello del donatore che dei reagenti CRISPR/Cas9. Se confermato, cercare di ottimizzare le dosi dei reagenti e il protocollo di somministrazione stesso. Una volta ottenuta la linea cellulare reporter, selezionare le sequenze promoter/enhancer del gene bersaglio e progettare un pannello di gRNA corrispondenti. Utilizzare strumenti di previsione in silico come Chopchop sia per identificare le sequenze di gRNA che per classificarle in termini di efficienza e specificità previste (Figura 2). Se non vengono recuperati gRNA, controllare la presenza del motivo adiacente al protospacer Cas9 canonico (PAM) (5′-NGG-3′) nella sequenza bersaglio. Se non sono presenti sequenze PAM, prendere in considerazione il passaggio a ETR basati su varianti Cas9 alternative indipendenti da PAM (non sono ancora stati pubblicati ETR con queste varianti) o il passaggio a piattaforme alternative di domini di legame del DNA, come ZFP53 o TALEs30. Tuttavia, se vengono recuperati solo gRNA con bassa efficacia/specificità prevista, si consideri 1) testare questi gRNA di bassa qualità o 2) espandere la sequenza di DNA bersaglio, alla ricerca di gRNA migliori. Dopo la somministrazione transitoria della tripla combinazione di ETR (o CRISPRoff; v2.1) insieme ai gRNA, eseguire analisi di citometria a flusso longitudinale per l’espressione del reporter fluorescente, spesso osservando un picco di repressione del reporter alle analisi acute, che viene poi almeno parzialmente riassorbito a causa della diluizione mitotica dei plasmidi codificanti ETR nel tempo (Figura 4C). Se la combinazione ETR/gRNA deposita efficacemente la metilazione di CpG sul locus bersaglio, si verificherà una repressione permanente del reporter in una frazione considerevole di cellule trattate (Figura 4C). Diversi gRNA possono mostrare un’efficienza di silenziamento variabile a lungo termine (Figura 4B,C). Per le valutazioni della specificità dell’intero genoma, utilizzare MeDIP-seq per identificare le regioni differenzialmente metilate tra le cellule in cui il bersaglio è stato silenziato a lungo termine e cellule non trattate. Idealmente, un gRNA altamente specifico indurrà solo un picco di metilazione de novo di CpG nel sito bersaglio (Figura 5). In caso contrario, si può considerare di caratterizzare l’attività off-target dei gRNA classificati in una posizione inferiore nell’elenco dell’efficienza on-target. Figura 1: Integrazione di un reporter tdTomato sotto gli elementi regolatori del gene B2M umano mediante riparazione diretta dall’omologia. In alto: Schemi della strategia per integrare un reporter fluorescente tdTomato nel primo introne del gene B2M umano mediante riparazione diretta dall’omologia indotta da CRISPR/Cas9. In basso: dot plot rappresentativi di cellule K-562 pre- e post-integrazione del reporter tdTomato nel primo introne del gene B2M . Abbreviazioni: HA = braccio di omologia; HDR = riparazione diretta per omologia; IRES = sito di ingresso interno del ribosoma; pa = BGH poli(A); SA = sito accettore di giunzione; WT = tipo selvatico; 3XSTOP = tre codoni di arresto in tandem. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Identificazione in silico di gRNA mirati all’isola CpG del gene B2M , classificati in base all’efficienza e alla specificità previste. L’interfaccia di output di Chopchop mostra i gRNA che prendono di mira l’isola CpG incorporata nella sequenza del promotore del gene B2M , classificata sia per il numero di sequenze off-target con 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) o 3 (MM3) mismatch sia per l’efficienza on-target prevista. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Clonaggio e nucleofezione arrayed di gRNA per silenziamento epigenetico mediato da ETR dCas9. In alto: clonaggio protospacer mediato da oligo in un plasmide umano esprimente U6-gRNA. In basso: screening di gRNA mirati a B2M per il silenziamento epigenetico basato su CRISPR/dCas9 mediante nucleofezione plasmidica in cellule K-562B2M/tdTomato Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Screening dei gRNA che inducono efficacemente il silenziamento a lungo termine del gene B2M. (A) In alto: schemi del geneb2M tdTomato raffigurati nell’area ingrandita, l’ordine relativo e l’orientamento di legame di ETR basati su dCas9 complessati con gRNA. In basso: dot plot rappresentativi delle celluleB2M tdTomato K-562 prima (a sinistra) o dopo (a destra) il silenziamento ETR. Analisi a 30 giorni dalla trasfezione con plasmidi codificanti per i gRNA e la tripla combinazione dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L. (B) Attività di silenziamento dei gRNA indicati (sia in pool che come singoli gRNA) che hanno come bersaglio l’isola CpG di B2M (le frecce rosse nello schema in alto indicano l’orientamento dei gRNA) nelle cellule di pomodoro K-562 B2M tdTomato al giorno 30 post-trasfezione. I dati mostrano la percentuale di cellule tdTomato-negative (media ± SEM; n = quattro trasfezioni indipendenti per ciascuna condizione di trattamento). (C) Analisi del decorso temporale di cellule B2MtdTomato K-562 dopo trasfezione con plasmidi che esprimono la tripla combinazione di ETR e i gRNA o mock mirati alle isole B2M CpG indicati (trasfezione senza gRNA e ETR). I dati mostrano la percentuale di cellule tdTomato-negative (media ± SEM; n = tre trasfezioni indipendenti per ciascuna condizione di trattamento). Dati inediti. I pannelli A e B sono stati adattati da Amabile et al.30. Abbreviazioni: CGI = isola CpG; IRES = sito di ingresso interno del ribosoma; pa = BGH poli(A); SA = sito accettore di giunzione; SD = sito donatore di giunzione; TSS = sito di inizio della trascrizione; UT = non trasfettato; 3XSTOP = 3 codoni di arresto in tandem. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Analisi a livello genomico della specificità dell’ETR mediante RNA-seq e MeDIP-seq. A sinistra: confronto dei livelli di espressione in celluleB2M tdTomato K-562 trattate con mock e cellule trattate con la tripla combinazione ETR dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L e con un gRNA mirato all’isola CpG del gene B2M. I valori sono espressi in log2 di letture per kilobase per milione (RPKM) di letture mappate. I punti neri rappresentano geni espressi a livelli comparabili in tutte le condizioni; i cerchi gialli rappresentano i geni regolati in modo differenziato sotto un FDR <0,01; il cerchio rosso rappresenta la trascrizione B2M-IRES-tdPomodoro. In alto a destra: grafico circos che mostra i profili MeDIP-seq dell’intero genoma di celluleB2M tdTomato K-562 trattate con mock (blu) o cellule trattate con la tripla combinazione ETR dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L e con un gRNA mirato all’isola CpG (CGI) del gene B2M (verde). In basso a destra: è mostrato lo stato di metilazione del locusb2M tdTomato nei campioni indicati. In ogni pile-up sono rappresentate tre repliche; L’accumulo di letture allineate è stato smussato utilizzando una finestra gaussiana. Questa figura è stata adattata da Amabile et al.30. Abbreviazione: TSS = sito di inizio della trascrizione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il silenziamento epigenetico mirato può rappresentare una soluzione promettente per il trattamento di malattie che possono beneficiare dell’inattivazione genica permanente, comprese le malattie causate da mutazioni con guadagno di funzione1, le malattie infettive2 e le patologie in cui il silenziamento di un gene può compensare un difetto ereditario in un altro3 o liberare il pieno potenziale delle terapie cellulari adottive4, 5. Introduzione Agendo a livello della cromatina ed essendo auto-propagato dalla cellula 7,30,32, il silenziamento epigenetico può evitare alterazioni tossiche (ad esempio, riarrangiamenti cromosomici) della sequenza di DNA del gene bersaglio e silenziamento parziale e transitorio del bersaglio, che sono limitazioni della distruzione genica artificiale basata sulla nucleasi8,34,35 e del knockdown basato sull’RNAi 33, rispettivamente.

Uno dei passaggi preliminari chiave in qualsiasi protocollo di silenziamento epigenetico è quello di identificare la posizione corretta sul gene bersaglio per dirigere gli ETR che depositeranno i segni epigenetici repressivi necessari per spegnere l’attività trascrizionale del bersaglio. Diversi elementi regolatori del sito di inizio trascrizionale, prossimale e distale, possono concorrere a supportare l’output trascrizionale di un dato gene umano54. Inoltre, grazie al crescente numerodi tecnologie programmabili di legame del DNA 6, è ora possibile identificare diversi siti bersaglio per ogni specifico elemento regolatorio. Pertanto, i protocolli, come quello qui descritto nelle linee cellulari ingegnerizzate, possono essere utilizzati per nominare singoli siti bersaglio e/o regioni genomiche suscettibili di silenziamento epigenetico mediato da ETR, prima di intraprendere sforzi di valutazione ingombranti e dispendiosi in termini di tempo dei migliori candidati nel setting terapeutico finale. Alcuni aspetti critici del protocollo sono ulteriormente descritti di seguito.

Ingegnerizzazione di una linea cellulare reporter predittiva del bersaglio terapeutico finale
Nonostante la costante ottimizzazione dei protocolli di ingegneria cellulare – qui necessari per inserire la cassetta codificante per il reporter fluorescente nel gene bersaglio e per veicolare gli ETR – non si può dare per scontato che possano essere già disponibili per la linea cellulare che più assomiglia al bersaglio terapeutico finale. In questo caso, possono essere applicate diverse strategie di mitigazione: a) sfruttando i kit di ottimizzazione forniti dai vendor per ottimizzare internamente il protocollo di trasfezione per la linea cellulare target; b) passaggio ad altre linee cellulari che esprimono ancora quel gene bersaglio ma appartenenti a tessuti diversi dal bersaglio terapeutico finale, per i quali i protocolli di ingegneria sono stati ampiamente ottimizzati. Nel caso in cui queste opzioni non siano disponibili, si può considerare di passare a tipi di cellule primarie o organoidi che rappresentano il bersaglio finale. Come considerazione generale sia per gli studi preclinici che per le applicazioni terapeutiche del silenziamento epigenetico basato su ETR, gli scenari in cui il gene bersaglio è essenziale per il tipo di cellula bersaglio dovrebbero essere scartati. Il silenziamento completo e a lungo termine di un gene essenziale imposto dagli ETR porterà alla controselezione delle cellule bersaglio nel tempo (e, potenzialmente, alla tossicità del trattamento). In questi casi sono preferibili tecnologie alternative che prevedono l’abrogazione parziale del bersaglio, come l’RNAi33.

Valutazione dell’attività di silenziamento on-target degli ETR
Gli ETR basati sulla combinazione di domini effettori KRAB, DNMT3A e DNMT3L si sono dimostrati efficaci contro la grande maggioranza dei geni codificanti proteine, con un’ampia finestra di targeting permissiva lunga circa 1 kilobase centrata sul sito di inizio della trascrizione32. Per avere un’idea di come appare un esperimento di silenziamento epigenetico ben eseguito, i dettagli tecnici e i risultati del silenziamento del gene B2M nelle cellule K-562 sono forniti qui. Questo può essere considerato un importante controllo positivo da includere non solo da parte dei ricercatori che lavorano con le cellule K-562 ma anche da parte di coloro che si avvicinano per la prima volta alla tecnologia basata su ETR. Come indicato nel protocollo, la distruzione genica basata sulla nucleasi artificiale (ad esempio, CRISPR/Cas9) è raccomandata come ulteriore controllo sia dell’efficienza del rilascio genico nel tipo di cellula di interesse che del fenotipo delle cellule private del gene bersaglio. Dopo lo screening iniziale dei gRNA da accoppiare con gli ETR basati su CRISPR/dCas9, se nessuno dei gRNA testati è in grado di silenziare in modo permanente il gene bersaglio, si dovrebbe considerare, nel seguente ordine: 1) aumentare la quantità di gRNA e ETR consegnati; 2) testare pool dei migliori gRNA alla ricerca di effetti sinergici tra di loro. Se il silenziamento a lungo termine non è ancora raggiunto, si dovrebbe prendere in considerazione: 3) testare ulteriori gRNA, che possono mirare a siti più rilevanti per istruire il silenziamento epigenetico; 4) passaggio a piattaforme DBD basate su ZFP8 o TALE9, che possono avere una migliore capacità di legame con la cromatina bersaglio; 5) il passaggio da transiente a stabile, ad esempio, integrando l’espressione basata su vettori virali degli ETR (sia il costrutto di fusione gRNA che quello dCas9 o entrambi quando si adotta la tecnologia CRISPR/dCas9). Dal momento che il nostro gruppo ha sviluppato, e ha una solida esperienza, la co-consegna dei tre ETR separati30, il protocollo e i risultati qui mostrati si basano su questo approccio. Tuttavia, un flusso di lavoro concettuale simile può essere probabilmente applicato a un sistema all-in-one basato su CRISPR32.

Valutazione dell’attività off-target degli ETR
Diversi studi hanno mostrato indicazioni preliminari in vitro della specificità degli ETR basati sulla combinazione dei domini effettori30,31,32 di KRAB, DNMT3A e DNMT3L. Tuttavia, se tra i gRNA testati, nessuno di essi mostra un profilo di specificità soddisfacente in termini di regolazione trascrizionale e/o metilazione del DNA de novo, si possono perseguire due strategie che non si escludono a vicenda: a) ridurre il tempo di permanenza degli ETR all’interno della cellula (e di conseguenza la loro potenziale attività off-target) diminuendo le dosi di ETR o testando sistemi di rilascio alternativi. Ad esempio, rispetto ai plasmidi, sia l’mRNA che il rilascio di proteine dovrebbero ridurre il tempo di esposizione delle cellule agli ETR e, di conseguenza, la probabilità di attività off-target55; b) passaggio a varianti più recenti di Cas9, ottimizzate per ridurre il legame off-target della piattaforma56, o a tecnologie alternative di legame del DNA basate su ZFP8 o TALE9. E’ importante considerare che, rispetto ai campioni trattati con simulazione, l’attività on-target e off-target del silenziamento genico è influenzata non solo dal legame della DBD alla loro sequenza bersaglio, ma anche dalla potenziale capacità dei domini effettori epigenetici di essere reclutati in altri loci dai loro cofattori naturali ed endogeni. Pertanto, la riduzione del tempo di permanenza degli ETR nella cellula bersaglio può diminuire non solo la probabilità di legame del DBD a siti off-target, ma anche la probabilità che gli ETR interagiscano con cofattori endogeni, con potenziali benefici in termini di specificità e svantaggi in termini di attività on-target. Infine, rispetto ai campioni trattati con simulazione, alcune delle alterazioni della metilazione trascrizionale e, meno probabile, di CpG misurate nelle cellule silenziate possono essere semplicemente derivate dalla privazione del gene bersaglio. Questi non sono considerati fuori bersaglio della tecnologia di silenziamento. Per identificarli, si dovrebbe anche includere la distruzione genica da nucleasi artificiale nel pannello sperimentale 8,9,10. Le alterazioni biologiche dovute alla perdita funzionale del gene bersaglio saranno condivise tra il silenziamento epigenetico e questa tecnologia alternativa.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica e Deborah Cipria per lo sforzo collaborativo nello sviluppo della tecnologia di silenziamento epigenetico nel corso degli anni; Dejan Lazarevic e Francesca Giannese per la revisione critica delle analisi RNA-seq e MeDIP-seq descritte nel protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni ad A.L. da parte della Fondazione Telethon (sovvenzione TIGET n. F1) e del programma europeo Horizon 2020 (UPGRADE). Le illustrazioni sono state create con BioRender.com.

CONTRIBUTO DEGLI AUTORI
A.M., M.A.C., F.G. e A.C. hanno contribuito alla stesura del protocollo e alla stesura del manoscritto; S.V., I.M. e D.C. hanno progettato le sezioni bioinformatiche del protocollo e hanno revisionato il manoscritto; A.M. e A.L. hanno progettato il protocollo, ideato e scritto il manoscritto con il contributo di tutti gli autori.

Materials

4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

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 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 
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References

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Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).
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