JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
العربية

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

في المختبر اختيار مثبطات النسخ المهندسة لإسكات الجينات اللاجينية المستهدفة

Published: May 05, 2023
doi:
10.3791/64403
, , , , , , ,
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget),IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences,IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies,National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا للاختيار المختبري لمثبطات النسخ الهندسية (ETRs) ذات كفاءة إسكات عالية وطويلة الأجل ومستقرة وعلى الهدف ونشاط منخفض على مستوى الجينوم وخارج الهدف. يسمح سير العمل هذا بتقليل ذخيرة أولية معقدة من ETRs المرشحة إلى قائمة قصيرة ، مناسبة لمزيد من التقييم في الإعدادات ذات الصلة بالعلاج.

Abstract

يعد تعطيل الجينات مفيدا لدراسة وظيفة الجينات ويمثل استراتيجية واعدة لعلاج مجموعة واسعة من الأمراض. من بين التقنيات التقليدية ، يعاني تداخل الحمض النووي الريبي من إلغاء جزئي للهدف ومتطلبات العلاج مدى الحياة. في المقابل ، يمكن أن تفرض النيوكليازات الاصطناعية تعطيلا مستقرا للجين من خلال تحريض كسر حبلا مزدوج للحمض النووي (DSB) ، لكن الدراسات الحديثة تشكك في سلامة هذا النهج. قد يمثل التحرير اللاجيني المستهدف عبر مثبطات النسخ الهندسية (ETRs) حلا ، حيث يمكن أن تؤدي إدارة واحدة لمجموعات ETR محددة إلى إسكات دائم دون إحداث فواصل الحمض النووي.

ETRs هي بروتينات تحتوي على مجال ربط الحمض النووي القابل للبرمجة (DBD) والمستجيبات من مثبطات النسخ التي تحدث بشكل طبيعي. على وجه التحديد ، تبين أن مزيجا من ثلاثة ETRs مجهزة بمجال KRAB ل ZNF10 البشري ، المجال الحفاز ل DNMT3A البشري و DNMT3L البشري ، يحفز حالات جينية قمعية وراثية على الجين المستهدف ETR. إن طبيعة الكر والفر لهذه المنصة ، وعدم وجود تأثير على تسلسل الحمض النووي للهدف ، وإمكانية العودة إلى الحالة القمعية عن طريق إزالة ميثيل الحمض النووي عند الطلب ، تجعل إسكات الجينات اللاجينية أداة لتغيير قواعد اللعبة. تتمثل الخطوة الحاسمة في تحديد موضع ETRs المناسب على الجين المستهدف لتحقيق أقصى قدر من الإسكات خارج الهدف وتقليل الإسكات خارج الهدف. يمكن أن يكون تنفيذ هذه الخطوة في الإعداد قبل السريري النهائي خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي أمرا مرهقا.

بأخذ نظام CRISPR / Cas9 الميت تحفيزيا كنموذج DBD ل ETRs ، تصف هذه الورقة بروتوكولا يتكون من الشاشة المختبرية للحمض النووي الريبي الإرشادي (gRNAs) إلى جانب تركيبة ETR الثلاثية لإسكات فعالة على الهدف ، متبوعا بتقييم ملف تعريف الخصوصية على مستوى الجينوم لأعلى الضربات. وهذا يسمح بتقليص الذخيرة الأولية من gRNAs المرشحة إلى قائمة قصيرة من الواعدة ، والتي يكون تعقيدها مناسبا لتقييمها النهائي في إطار الاهتمام ذي الصلة من الناحية العلاجية.

Introduction

لعب تعطيل الجينات تقليديا دورا رئيسيا في دراسة وظيفة الجينات في كل من النماذج الخلوية والحيوانية. علاوة على ذلك ، في العقدين الماضيين ، مع ظهور العلاج الجيني ، تم اقتراحه كنهج يحتمل أن يغير قواعد اللعبة لعلاج الأمراض الناجمة عن طفرات اكتساب الوظيفة1 ، أو الأمراض المعدية2 ، أو الأمراض التي قد يعوض فيها إسكات أحد الجينات عن عيب وراثي في جين آخر3. أخيرا ، تم اقتراح التعطيل الجيني للمنظمين الرئيسيين للياقة الخلية والتحكم الوظيفي لتعزيز كفاءة منتجات الخلايا للعلاج المناعي للسرطان4 والطب التجديدي5.

من بين التقنيات المختلفة لتحقيق تعطيل الجينات ، واحدة من أكثرها واعدة هي الإسكات اللاجيني المستهدف 6,7. في صميم هذه التقنية يوجد ما يسمى بمثبطات النسخ الهندسية (ETRs) ، وهي بروتينات خيمرية تتكون من مجال ربط الحمض النووي القابل للبرمجة (DBD) ومجال المستجيب (ED) مع وظيفة قمعية جينية. يمكن تصميم بروتينات إصبع الزنك (ZFPs)8 ، أو المستجيبات الشبيهة بمنشط النسخ (TALEs)9 ، أو DBDs المستندة إلى CRISPR / dCas910 لربط الضعف الجنسي بشكل انتقائي بتسلسل المروج / المحسن للجين المستهدف المراد إسكاته. بمجرد الوصول إلى هناك ، يؤدي الضعف الجنسي في ETR نشاط إسكات الصوت عن طريق فرض علامات جينية قمعية تحفز heterochromatin مثل تعديلات الهستون (H3K9 11,12 أو H3K27 13 مثيلة ، H3 أو H4 deacetylation14) ومثيلة الحمض النووي CpG 15 ، وفقا للمجال القمعي المستخدم.

على وجه الخصوص ، مستوحاة من العمليات الجزيئية للقمع النسخي الدائم للفيروسات القهقرية الداخلية التي تحدث في الجنين16 قبل الزرع ، تم إنشاء مزيج من ثلاثة ETRs لاستغلال EDs التالية: ط) مجال الصندوق المرتبط ب Krüppel (KRAB) للإنسان ZNF10 ؛ ب) المجال الحفاز للإنسان دي نوفو DNA methyltransferase 3A (DNMT3A) ؛ و iii) الحمض النووي البشري الكامل الطول ميثيل ترانسفيراز 3 مثل (DNMT3L). KRAB هو مجال قمعي محفوظ يتقاسمه العديد من ZFPs في الفقاريات العليا 17,18 ، والتي يعتمد نشاطها في الإسكات بشكل أساسي على قدرتها على تجنيد KAP1 19-بروتين سقالة يتفاعل بعد ذلك مع العديد من محرضات heterochromatin الأخرى 20 – التي تضم معقد إعادة تشكيل النيوكليوسوم وإزالة الأستيل (NuRD) 21 ، و H3K9 هيستون ميثيل ترانسفيراز SETDB1 22 ، وقارئ مثيلة H3K9 HP1 23 ، 24 ، من بين أمور أخرى.

ينقل DNMT3A بنشاط مجموعات الميثيل على الحمض النووي في تسلسل CpG25. يتم تعزيز النشاط التحفيزي ل DNMT3A من خلال ارتباطه الفيزيائي مع DNMT3L ، وهو بارالوج مقيد بالخلايا الجنينية والجرثومية ل DNMT3A يفتقر إلى المجال الحفاز المسؤول عن نقل مجموعة الميثيل26,27. عادة ما ترتبط مثيلة الحمض النووي في المناطق الغنية ب CpG – المشار إليها باسم جزر CpG (CGIs) – المضمنة في عناصر المروج / المحسن لجينات الثدييات بإسكات النسخ28. الأهم من ذلك ، بمجرد ترسبها ، يمكن توريث مثيلة CpG بثبات في جميع أنحاء الانقسام بواسطة مركب جزيئي قائم على UHRF1-DNMT129.

يمكن أن يكون التعبير المفرط المستقر ل ETRs في الخلية المستهدفة مشكلة ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة مخاطر النشاط خارج الهدف وسحق التفاعلات الداخلية من مواقعها المستهدفة الفسيولوجية بمرور الوقت. ومع ذلك ، يمكن أن يفشل التعبير العابر عن أجزاء ETR المفردة في إحداث إسكات طويل الأجل بكفاءةعالية 30 ، مما يعيق تطبيقها العلاجي. لذلك ، كان الاختراق الأساسي في هذا المجال هو الدليل على أن الجمع بين ثلاثة ETRs المستندة إلى KRAB و DNMT3A و DNMT3L يمكن أن يتآزر ، وحتى عندما يتم تسليمه بشكل عابر فقط ، يفرض على تسلسل المروج للجين المستهدف H3K9 ومثيلة CpG. ثم تتم قراءتها ونشرها بواسطة الخلية في جميع أنحاء الانقسام ، مما يؤدي إلى إسكات وراثي في خطوط خلايا بشرية وفأر متعددة ، بالإضافة إلى الخلايا الأولية المستزرعة خارج الجسم الحي 30.

وتجدر الإشارة إلى أن الإسكات اللاجيني الذي تفرضه ETRs يمكن التراجع عنه عند الطلب من خلال استهداف (على سبيل المثال ، توظيف مزيل الحمض النووي TET1 القائم على CRISPR / dCas9 على الموضع الصامت) أو الدوائية (إعطاء مثبط ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي 5-Aza) إزالة ميثيلالحمض النووي 30 ، وهو ترياق محتمل في حالة الأحداث الضائرة المرتبطة ب ETR. كما تم وصف ETRs الكل في واحد التي تحمل EDs الثلاثة المستندة إلى KRAB- و DNMT3A و DNMT3L ، مما يدل على كفاءات إسكات كبيرة في خطوط الخلايا31,32 مقابل الغالبية العظمى من الجينات المشفرة للبروتين. علاوة على ذلك ، أبلغت العديد من الدراسات التي تستخدم ETRs عن ملف أمان عالي ، مع عدم وجود نشاط كبير خارج الهدف من حيث مثيلة CpG الجديدة أو تغيير إمكانية الوصول إلى الكروماتين 30،31،32. ومع ذلك ، يوصى بإجراء تحليل مخصص لملف تعريف خصوصية ETRs المجهز ب DBD المصمم حديثا قبل التطبيقات السريرية.

من منظور سريري ، قد يوفر الإسكات اللاجيني المستهدف مزايا حاسمة لكل من الضربة القاضية القائمة على تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi)33 وتعطيل الجينات الاصطناعيةالقائمة على النيوكلياز 8. على عكس RNAi ، قد يؤدي الإسكات اللاجيني المستهدف إلى الإلغاء الكامل لهدفه لكل خلية ولا يتطلب علاجا دوريا لضمان إسكات طويل الأجل ؛ على عكس الاضطراب الجيني ، فإنه يترك تسلسل الحمض النووي دون تغيير ، وتجنب توليد فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs). يمكن أن تحفز DSBs بعد ذلك موت الخلايا المبرمج وتوقف دورة الخلية ، مما قد يؤدي إلى اختيار الخلايا ذات المسار الوظيفي p53 34,35 ، وخاصة في إعدادات تحرير الجينات المتعددة ، إعادة ترتيب الكروموسومات35. علاوة على ذلك ، من خلال نقل النتيجة الفسيفسائية التي لا رجعة فيها لإصلاح الحمض النووي DSB بوساطة الحمض النووي غير المتماثل36 ، لا يمكن لتعطيل الجينات تجنب الإصلاح داخل الإطار للهدف في تسلسلات ترميز وظيفية كواحدة من النتائج النهائية ، وعلى عكس الإسكات اللاجيني ، لا يمكن محوها عند الطلب.

أخيرا ، يحمل الإسكات اللاجيني القدرة على توسيع نطاق العناصر الجينية القابلة للاستهداف إلى فئات مقاومة كليا أو جزئيا على الأقل ل RNAi وتعطيل الجينات ، مثل العناصر التنظيمية غير المنسوخة والحمض النووي الريبي غير المشفر30,32. تتمثل الخطوة الحاسمة الأولى لأي تطبيق مستهدف لإسكات الجينات اللاجينية في تصميم لوحة من ETRs تغطي التسلسلات التنظيمية المختلفة للجين المستهدف وتحديد أفضل التسلسلات أداء. يمكن أن يكون عدد ETRs التي سيتم اختبارها أمرا بالغ الأهمية ، مع الأخذ في الاعتبار الجزء المتزايد من الجينوم الذي يمكن استهدافه بواسطة تقنيات ربط الحمض النووي القابلة للبرمجة قيد التطوير باستمرار37. إن إجراء شاشة ETRs مباشرة على نوع الخلية التي يمكن فيها إسكات الجين المستهدف علاجيا سيمثل الخيار الأكثر صلة. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الشاشات عالية الإنتاجية مرهقة تقنيا في الخلايا الأولية بسبب بقائها المحدود في الثقافة وقدرتها الهندسية دون المستوى الأمثل في كثير من الأحيان. يمكن أن تكون الشاشات واسعة النطاق غير مجدية في الجسم الحي.

يتمثل البديل الأكثر عملية في إجراء فحص أولي للوحة كبيرة من ETRs في خطوط الخلايا القابلة للهندسة بسهولة في البداية ، ثم التحقق فقط من صحة أكثرها واعدة في نوع الخلية ذات الصلة علاجيا. وثمة مسألة موازية تتمثل في اختيار قراءات مناسبة لقياس كفاءة إسكات لوائح الاتصالات الكهربائية. يمكن أن يكون التقييم المباشر للنسخة أو مستويات البروتين للجين المستهدف بواسطة RT-qPCR أو اللطخة الغربية أو ELISA مكلفا ويستغرق وقتا طويلا وقد يفتقر إلى الحساسية الكافية ، مما يحد من تطبيقها على المقاييس عالية الإنتاجية. إن توليد خطوط خلايا مراسلة مهندسة خصيصا يتم فيها وضع الفلوروفور تحت التحكم النسخي للتسلسلات التنظيمية للجين المستهدف يسمح باستغلال النهج القائم على قياس التدفق الخلوي لقراءة الإسكات اللاجيني على مستوى الخلية الواحدة وبوتيرة عالية الإنتاجية.

بعد هذه الاعتبارات العامة ، تصف هذه الورقة بروتوكولا يتكون من شاشة مصفوفة في المختبر من ETRs لكفاءة إسكات الهدف ، متبوعا بتقييم النشاط خارج الهدف على مستوى الجينوم لأعلى الضربات. يسمح سير العمل هذا بتقليل الذخيرة الأولية ل ETRs المرشحة إلى قائمة قصيرة من التقارير الواعدة ، والتي يكون تعقيدها مناسبا لتقييمها النهائي في نوع الخلية ذات الصلة علاجيا ذات الأهمية.

من بين DBDs المختلفة القابلة للبرمجة التي يمكن استغلالها لتوليد ETRs ، سيركز هذا البروتوكول على التكنولوجيا القائمة على CRISPR / dCas9 ، بسبب سهولة تصميم gRNAs التي تغطي محفز الجينات المستهدف على نطاق عالي الإنتاجية. ومع ذلك ، يمكن اعتماد نفس سير العمل المفاهيمي الموضح أدناه لتقييم كفاءة وخصوصية ETRs المجهزة ب DBDs الأخرى.

Protocol

1. هندسة خط خلية مراسل قائم على التألق لمراقبة نشاط النسخ للجين المستهدف عن طريق قياس التدفق الخلوي تحديد خطوط الخلايا التي تعبر عن الجين المستهدف المراد إسكاته. تصفح الجين المستهدف ليتم إسكاته في أطلس البروتين البشري38 وانتقل عبر قسم “خط الخلية” لتحديد تلك الخطوط التي تمثل النسيج الجسدي محل الاهتمام (على سبيل المثال ، خط خلية كبدية إذا كانت الأهداف النهائية هي خلايا الكبد الكبدية). بدلا من ذلك ، استجوب قاعدة بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المتاحة للجمهور (RNA-Seq) (على سبيل المثال ، NCBI GEO). من بين المرشحين ، إعطاء الأولوية لخطوط الخلايا التي تتوفر لها بروتوكولات توصيل الجينات العابرة الفعالة – وهي مفيدة لتوصيل ETR.ملاحظة: من بين الطرائق المختلفة ، يمثل nucleofection أحد أفضل الخيارات ، لأنه يضمن كفاءة نقل عالية. هنا ، تم اختيار خلايا الكريات الحمر البشرية K-562 لإنشاء خط خلوي يبلغ عن نشاط النسخ لجين بيتا 2-ميكروغلوبولين (B2M) (يشار إليه فيما يلي باسم خلايا B2M TdTomato K-562). مزيد من إعطاء الأولوية للمرشحين لتجنب خطوط الخلايا التي يكون فيها الجين المستهدف ضروريا لبقاء الخلية ، لأن هذا يضعف الحفاظ على الخلايا مع إسكات مستقر للجين المستهدف في الثقافة. إذا لم يتم الإبلاغ عنها مسبقا ، للحصول على إحساس بأهمية الجين المستهدف في نوع الخلية المختار ، قم بتوليد تحكم في الاضطراب الجيني عن طريق نقل الخلايا باستخدام Cas9 nuclease و gRNA الذي يستهدف أحد أول إكسونات الترميز للجين.ملاحظة: الاضطراب الجيني هو حدث مستقر بحكم التعريف. يشير الانتقاء المضاد للخلايا المعطلة بمرور الوقت إلى أن الجين المستهدف ضروري لفسيولوجيا الخلية المختارة.تحديد الشكل المتماثل للربط المستهدف المستخدم بشكل تفضيلي في خط الخلية المحدد (يتم استهداف الشكل المتماثل NM_004048.4 لجين B2M في هذا البروتوكول). حدد gRNA الذي يمكن أن يقطع بشكل فعال وعلى وجه التحديد في أول إكسون مشفر للشكل المتماثل المستهدف (على سبيل المثال ، Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/) 39 ، وهي أداة اختيار gRNA صالحة وسهلة الاستخدام عبر الإنترنت). بالنسبة لخلايا K-562 ، قم بنقل 1 ميكروغرام من البلازميد المشفر spCas9 (hCas9 ؛ انظر جدول المواد) و 250 نانوغرام من البلازميد المشفر للحمض النووي الريبي (phU6-gRNA ؛ انظر جدول المواد) لكل 5 × 105 خلايا من خلال nucleofection (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة). استزراع الخلايا (خلايا K-562 عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2 في RPMI-1640 مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ [FBS] ، L-glutamine ، والبنسلين / الستربتومايسين [100 وحدة / مل]) ومراقبة مستويات اضطراب الجينات بمرور الوقت من خلال استغلال مجموعة اكتشاف الطفرات (اتبع تعليمات الشركة المصنعة). استنساخ قالب مانح للتكامل بوساطة إعادة التركيب المتماثل لمراسل الفلورسنت تحت التحكم النسخي للجين المستهدف محل الاهتمام (الشكل 1).حدد منطقة الجين المستهدف لدمج شريط التعبير الفلوروفور.ملاحظة: تجنب استهداف العناصر ذات الصلة بالنسخ، مثل جزر ومناطق CpG المخصبة لأستلة H3K27 (علامة المروجين والمعززات النشطة). إن تغيير هذه العناصر التنظيمية (التي يحتمل أن تكون مهمة لاستهدافها من قبل ETRs لتوجيه الإسكات اللاجيني) يجعل خط خلية المراسل أقل تنبؤا بالتنظيم الفسيولوجي للجين المستهدف.إذا لم يشفر الجين المستهدف لبروتين مفرز ، فقم بدمج المراسل مع الكودون الأخير للجين المستهدف من خلال ببتيد 2A ذاتي الشق للحفاظ على وظيفة الجين المستهدف. إذا كان الجين المستهدف يشفر لبروتين مفرز ، لتجنب الإفراز المحتمل للمراسل ، ضع المراسل في منطقة إنترونية من الجين المستهدف. يؤدي دمج قوة المراسل في النسخة المقسمة من خلال موقع متقبل لصق (SA) والترجمة اللاحقة من خلال تسلسل إدخال الريبوسوم الداخلي (IRES) إلى إضعاف وظائف الجين المستهدف. استخدم Chopchop لتحديد قطع gRNA في المنطقة المستهدفة (هنا ، يتم تحديد gRNA لاستهداف التسلسل 5′-AGGCTACTACCCCCCCATCAAGAGG-3′ من أول إنترون لجين B2M ). تصميم قالب مانح لموقع قطع gRNA يتكون من: i) ذراع التماثل الأيسر (أزواج قاعدة n [bp] مطابقة للمنطقة الموجودة أعلى موقع قطع gRNA) ؛ ب) شريط تعبير جيني محوري خال من المروج (في الحالة الموضحة هنا ، SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly (A) يفضل الربط مع أول إنترون من جين B2M ) ؛ و iii) ذراع التماثل الأيمن (n bp مطابقة للمنطقة الواقعة في اتجاه مجرى موقع قطع gRNA).ملاحظة: يمكن أن يختلف طول أذرع التماثل اللازمة للحث بشكل فعال على إعادة التركيب المتماثل بين أنواع الخلايا المختلفة (100-500 bp هو النطاق المناسب لخلايا K-562). قم بتسليم نظام CRISPR / Cas9 nuclease وقالب المتبرع داخل خط الخلية المستهدفة. بالنسبة لخلايا K-562 ، قم بنقل 1 ميكروغرام من البلازميد المشفر spCas9 (hCas9 ؛ انظر جدول المواد) ، و 250 نانوغرام من البلازميد المشفر للحمض النووي الريبي (phU6-gRNA ؛ انظر جدول المواد) ، و 1 ميكروغرام من البلازميد المشفر للقالب المانح لكل 5 × 105 خلايا من خلال nucleofection (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة). استزراع الخلايا لمدة 14 يوما على الأقل (لخلايا K-562) ومراقبة مستويات التعبير لمراسل الفلورسنت بمرور الوقت باستخدام مقياس التدفق الخلوي (تنشيط قناة phycoerythrin (PE) لقياس شدة مضان مراسل tdTomato واتبع تعليمات الشركة المصنعة لإجراء قياس التدفق الخلوي).ملاحظة: يمكن أن يحتوي قالب المتبرع – خاصة إذا كان قائما على البلازميد – على تسلسلات مروج مشفرة ، مما يؤدي إلى التعبير عن مراسل الفلورسنت من نسخ المانحين غير المدمجة. تسمح زراعة الخلايا بتخفيف هذه النسخ غير المتكاملة عن طريق انقسام الخلايا وأخيرا الحفاظ على تعبير المراسل فقط من نسخ المتبرع المدمجة في الجينوم المستهدف. استنساخ الخلايا الإيجابية للمراسل من خلال فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) على مستوى خلية واحدة. بالنسبة لهذا البروتوكول ، قم بتنشيط قناة PE لقياس شدة التألق لمراسل tdTomato واتبع تعليمات الشركة المصنعة لفرز خلايا K-562 إيجابية tdtomato المفردة لكل بئر من صفيحة 96 بئرا. عند توسع الخلية في الثقافة (عادة 20-30 يوما لخلايا K-562) ، قم بفحص استنساخ مراسل إيجابي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل لاختيار واحد يحمل تكاملا ثنائي الأليل لشريط المراسل داخل الموضع المستهدف.ملاحظة: هذا يزيد من تعبير المراسل ويسهل المزيد من الحل بين الخلايا التي تعبر عن المراسل والخلايا التي يتم إسكاتها عن طريق قياس التدفق الخلوي عند علاج ETR.استخراج الحمض النووي الجينومي من 1 × 105 خلايا لكل استنساخ إيجابي للمراسل باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي (باتباع تعليمات الشركة المصنعة). قم بتضخيم المنطقة المستهدفة B2M باستخدام البادئات الأمامية (5′-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3′) والخلفية (5′-AATGGTTGAGTTGGAC-3′) باتباع تعليمات مجموعة تضخيم PCR. درجة حرارة التلدين لهذا الزوج من البادئات هي 47.7 درجة مئوية مع بوليميراز الحمض النووي القائم على Taq وتركيزات التمهيدي 0.5 ميكرومتر. تحليل منتج PCR باستخدام 1 ٪ هلام الاغاروز الكهربائي (باتباع تعليمات الشركة المصنعة). شاشة للمستنسخات تظهر النطاق المتعلق بتكامل tdTomato في موضع الهدف B2M (3,413 bp) ، بدون النطاق المتعلق بموضع الهدف من النوع البري (1,027 bp). 2. تصميم gRNAs لإسكات الجينات اللاجينية القائمة على كريسبر / dCas 9 للجين المستهدف تصفح الجين المستهدف في متصفح جينوم UCSC40 واستخرج تسلسل النوكليوتيدات للمناطق التي يحتمل أن تنظم نشاطها النسخي ، مثل جزر CpG والمواقع المخصبة لأستلة H3K27 (علامة المروجين والمعززات النشطة).ملاحظة: وفقا لدراسة حديثة ، فإن أفضل منطقة استهداف هي نافذة 1 كيلو قاعدة (kb) تتمحور حول موقع بدء النسخ للجين المستهدف32. الصق التسلسلات المحددة في أداة Chopchop عبر الإنترنت وحدد القمع كغرض من gRNAs المراد استردادها. انتظر حتى يقدم Chopchop قائمة ب gRNAs المعينة على التسلسل الجيني محل الاهتمام والمدرجة وفقا للدرجة مع الأخذ في الاعتبار كل من عدد التطابقات خارج الهدف والكفاءة المتوقعة على الهدف (الشكل 2). حدد 10 gRNAs على الأقل لكل تسلسل هدف. إذا أمكن ، حاول اختيار gRNAs الممتدة في جميع أنحاء المنطقة بأكملها ليتم استجوابها ، مع عدم وجود تطابقات كاملة مع التسلسلات الجينية الأخرى في جميع أنحاء الجينوم. 3. التسليم العابر المصطف ل ETRs المستندة إلى CRISPR / dCas 9 في خط خلية المراسل من بين أنظمة توصيل جينات التحوير التي تم الإبلاغ عنها سابقا لخط الخلية المستهدفة، اختر تلك التي تسمح فقط بالتعبير الجيني العابر العابر، وزيادة كفاءة التوصيل، وتقليل السمية المرتبطة بمعالجة الخلايا. في حالة خلايا K-562 ، يوصى بشدة باستخدام كل من نواة البلازميد والحمض النووي الريبوزي المرسال ، حيث يمثل إنتاج البلازميد بديلا أسهل وأرخص تقنيا. استنساخ كل من gRNAs المختارة في القسم 2 و ETRs المستندة إلى CRISPR / dCas9 في نظام توصيل الجينات المحورة المفضل. راجع الخطوات التالية للحصول على بروتوكول لاستنساخ ETRs في الحمض النووي البلازميدي.ملاحظة: البلازميدات المشفرة بشكل منفصل ل dCas9: KRAB و dCas9: DNMT3A و dCas9: DNMT3L30 غير متوفرة على Addgene. تم استنساخها عن طريق استبدال المنشط العابر VP160 من البلازميد pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (انظر جدول المواد) إما بتسلسل ترميز المجال KRAB أو DNMT3A أو DNMT3L30. يتوفر ترميز البلازميد ل ETR الكل في واحد ، المسمى CRISPRoff-v2.132 ، (انظر جدول المواد).تحويل ترميز البلازميدات ل ETRs في خلايا E. coli المختصة كيميائيا (باتباع تعليمات الشركة المصنعة). افحص المستعمرات بحثا عن وجود البلازميد الحامل ل ETR عن طريق تقييد هضم الإنزيم وتسلسل سانجر ، وأخيرا اختر إحدى المستعمرات الإيجابية لإنتاج الحمض النووي البلازميد Midiprep (باتباع تعليمات الشركة المصنعة). استنساخ gRNAs داخل العمود الفقري phU6-gRNA (الشكل 3).باستخدام برنامج تصميم البيولوجيا الجزيئية ، قم بإلحاق تسلسل 5′-CACCG-3 في المنبع من الفضاء الأولي (المتغير الأول 20 نيوكليوتيدات [nt] من gRNA المحدد) لتوليد oligo بطول 25 nt في السيليكو ، يشار إليه باسم SGfw. وبالمثل ، قم بإلحاق تسلسل 5′-AAAC-3 في المنبع من المكمل العكسي للفاصل الأولي لل gRNA المحدد و 5′-C-3′ في اتجاه مجرى النهر منه لتوليد oligo بطول 25 nt يشار إليه باسم SGrv. اطلب كلا من تسلسل SGfw و SGrv كأوليغو DNA أحادي الشريط خال من الملح ، يعاد تعليقه في الماء عند 100 ميكرومتر. أضف 1 ميكرولتر من كل oligo إلى 2 ميكرولتر من مخزن التلدين (10 mM Tris [pH 7.5-8.0] ، 50 mM NaCl ، 1 mM EDTA) و 16 μL من الماء. قم بإجراء تلدين oligo عن طريق وضع المحلول في جهاز تدوير حراري مبرمج للبدء عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم تبرد تدريجيا إلى 25 درجة مئوية خلال 45 دقيقة. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من oligos الملدن ب 99 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز ، ثم قم بربط 1 ميكرولتر من هذا التخفيف ب 50 نانوغرام من بلازميد phU6-gRNA الذي تم هضمه مسبقا باستخدام إنزيم تقييد BsaI (اتبع تعليمات BsaI وبائعي مجموعة ligase لإجراء الهضم والربط). تحويل 20 ميكرولتر من خلايا الإشريكية القولونية المختصة كيميائيا مع 2 ميكرولتر من منتج الربط (اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإجراء التحويل). اختر مستعمرات متعددة لإنتاج الحمض النووي البلازميد Miniprep (اتبع تعليمات البائع) وتحكم في الاستنساخ الناجح للفاصل الأولي عن طريق تسلسل سانجر مع مطابقة التمهيدي التالي لمروج U6 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3′. اختر واحدة من المستعمرات الإيجابية لإنتاج البلازميد DNA Midiprep (باتباع تعليمات الشركة المصنعة). قم بتوصيل gRNAs المحددة و ETRs المستندة إلى CRISPR / dCas9 في خط خلية المراسل في صفيف (gRNA محدد واحد لكل حالة) (الشكل 3).ملاحظة: كحالة تمثيلية ، يتم عرض سير العمل الخاص بترميز نواة البلازميدات ل dCas9: KRAB و dCas9: DNMT3A و dCas9: DNMT3L و gRNAs التي تستهدف جزيرة B2M CpG في خلايا B2M TdTomato K-562 في الخطوات التالية.قم بإعداد أنابيب منفصلة تحتوي على 500 نانوغرام من كل من بلازميدات ترميز dCas9: KRAB- و dCas9: DNMT3A- و dCas9: DNMT3L ، ولكنها تختلف عن اختبار gRNA (125 نانوغرام من بلازميد ترميز gRNA لكل أنبوب). قم بتضمين حالة نواة خالية من gRNA و ETR كعينة معالجة وهمية. قم بإجراء الشاشة باستخدام ثلاث نسخ مكررة فنية على الأقل لكل عينة. بيليه 5 × 105 B2M TdTomato K-562 خلايا لكل أنبوب و nucleofect لهم مع مزيج البلازميد (باتباع تعليمات الشركة المصنعة). أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من وسائط زراعة خلايا الثدييات RPMI-1640 التي تم تسخينها مسبقا ووضعها مرة أخرى في الحاضنة. 4. تحليل النشاط النسخي للجين المستهدف بمرور الوقت استخدم قياس التدفق الخلوي لقياس النسبة المئوية للخلايا الصامتة في نقاط زمنية مختلفة بعد تسليم ETRs (الشكل 4). استخدم خلايا من النوع البري (WT) – لا تحمل تسلسل ترميز الفلوروفور – لتعيين عتبة الخلايا السالبة للمراسل. استخدم العينة المعالجة الوهمية لتعيين البوابة للخلايا الإيجابية للمراسلين.ملاحظة: كما هو مقترح في الخطوة 1.3 ، قم بتضمين التحكم في الاضطراب الجيني في التجربة. يمكن أن يكون هذا مفيدا لكل من مراقبة كفاءة توصيل كريسبر ولياقة الخلايا المحرومة من الجين المستهدف. يمكن أن يعزى فقدان كل من إسكات النسخ والاضطراب الجيني بمرور الوقت إلى أهمية الجين المستهدف في نوع الخلية المختار. قم بتضمين نقاط زمنية قصيرة (اليوم 3 ، اليوم 7 ، اليوم 10) وطويلة الأجل (اليوم 21 ، اليوم 35) للحصول على مؤشر على كفاءة الإسكات الحادة والطويلة الأجل. تحديد أعلى ثلاثة gRNAs من حيث كفاءة إسكات الصوت على المدى الطويل. استخدم FACS لتحديد السكان الفرعيين السلبيين للمراسلين الذين تم الاحتفاظ بهم بثبات في تلك العينات. أيضا ، قم بإجراء FACS للعينات السائبة المعالجة وهمية لإبقائها تحت نفس المعاملة مثل عينات الاختبار للسماح بإجراء مقارنة مناسبة في التحليلات اللاحقة. 5. تقييم خصوصية علاج ETR بواسطة RNA-seq والترسيب المناعي للحمض النووي الميثيلي (MeDIP) -seq استخدم RNA-seq لتقييم أي تحرير نسخي على مستوى الجينوم في نهاية المطاف عند تسليم ETR.بالنسبة لكل من السكان الفرعيين الذين تم إسكاتهم من قبل المراسلين للعينات المعالجة بثلاثة gRNAs الأفضل أداء والخلايا المعالجة الوهمية ، استخرج الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعات متاحة تجاريا. تقييم جودة وتركيز الحمض النووي الريبي باستخدام المجموعات المتاحة تجاريا. قم بإجراء تجزئة الحمض النووي الريبي ، والنسخ العكسي ، وإعداد المكتبة باستخدام مجموعات متاحة تجاريا لإعداد مكتبات RNA-seq (باتباع إرشادات الشركة المصنعة). إجراء القياس الكمي للمكتبة ومراقبة الجودة باستخدام أدوات مراقبة الجودة المتوافقة مع تسلسل الجيل التالي والرحلان الكهربائي الرقمي. مكتبات التسلسل على جهاز التسلسل من الجيل التالي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مع بروتوكول نهاية مزدوجة 100 نقطة أساس ويهدف إلى متوسط 45 مليون قراءة / عينة. قم بمحاذاة علامات القراءة مع الجينوم المرجعي المناسب وحدد تعبير النص. قم بإجراء المحاذاة على تسلسل tdTomato وقم بتحديده بشكل منفصل.ملاحظة: هنا ، يتم استخدام محاذاة STAR (v 2.3.0) 43 ، مع المعلمات الافتراضية ، مقترنة بحزمة Rsubread44. إجراء تحليل لبيانات RNA-seq وفقا لأفضل الممارسات المنشورة45.ملاحظة: يتم استخدام حزمة R / Bioconductor edgeR46 هنا ، وتطبيق مرشح لا يقل عن عدد واحد لكل مليون (cpm) في ثلاث عينات على الأقل لتجاهل الجينات منخفضة التعبير. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام وظيفة filterByExpr في edgeR. تقييم التعبير الجيني التفاضلي باستخدام نموذج لوغاريتمي خطي معمم ذو حدين سلبي تم تنفيذه edgeR (وظيفة glmFit) 47. تعيين عتبة 0.01 على قيم p المعدلة (تصحيح Benjamini-Hochberg [BH]) للاحتفاظ بالجينات المنظمة بشكل تفاضلي. قم بتقييم أي نشاط مثيلة CpG خارج الهدف في نهاية المطاف ل ETRs بواسطة MeDIP-seq.بالنسبة لكل من السكان الفرعيين الذين تم إسكاتهم من قبل المراسلين للعينات المعالجة بأعلى ثلاثة gRNAs والخلايا المعالجة الوهمية ، استخرج الحمض النووي الجينومي باستخدام مجموعات متاحة تجاريا (باتباع تعليمات الشركات المصنعة). Sonicate 500 نانوغرام من الحمض النووي الجينومي باستخدام الموجات فوق الصوتية والمعلمات التالية: الواجب: 20 ٪ ؛ نقطة: 175; الدورات لكل انفجار: 200 ؛ الوقت: 40 ثانية. قم بإعداد مكتبات التسلسل باستخدام المجموعات المتاحة تجاريا ل MeDIP-seq (باتباع تعليمات الشركات المصنعة). بعد خطوة ربط المحول ، قم بقياس المكتبات عن طريق الفحص الفلوري وتحقق من كفاءة الربط بواسطة qPCR باستخدام مجموعات القياس الكمي للمكتبة المتاحة تجاريا (باتباع تعليمات الشركات المصنعة). احصل على تجمعات المكتبات عن طريق مزج المكتبات المختارة عشوائيا لتقليل التحيزات الفنية. استخدم كمية مكتبة متساوية (نانوغرام) لكل مكتبة لموازنة التجميعات. إلى كل مجموعة ، أضف الحمض النووي للتحكم في السنبلة الميثيلي وغير الميثيلي الموجود في المجموعة. لأغراض التحكم ، احتفظ بحجم 10٪ من المكتبة ، المسمى “مدخلات” وليس مناعيا. قم بإجراء الترسيب المناعي على 90٪ المتبقية من المكتبة باستخدام الجسم المضاد أحادي النسيلة الموجه ضد 5-methylcytosine المقدم في مجموعة MeDIP-seq. تنقية المكتبات المخصبة والمدخلات باستخدام مجموعات لتنقية منتج الترسيب المناعي 5-methylcytosine ، باتباع تعليمات الشركات المصنعة. قم بتقييم كفاءة التخصيب عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي على الارتفاع الداخلي في عناصر التحكم باستخدام الأساسيات المرفقة مع المجموعة. لكل ترسيب مناعي (IP) ، احسب خصوصية التخصيب من استعادة الحمض النووي الميثيلي وغير الميثيلي ، باستخدام قيم عتبة الدورة (Ct) ل MeDIP وكسور الإدخال التي تم الحصول عليها من تفاعل qPCR (انظر المعادلتين 1 و 2): (1) (2)ملاحظة: اعتبر مكتبات الملكية الفكرية ناجحة إذا كانت قيم الخصوصية ≥0.95. قم بتضخيم المكتبات باستخدام مجموعات إعداد مكتبة MeDIP-seq ، باتباع تعليمات الشركات المصنعة ، وقم بإجراء تحليل كمي وتحليل توزيع حجم المكتبة للمنتج. إجراء تسلسل المكتبة على أجهزة التسلسل من الجيل التالي. استخدم تسلسل الطرف المزدوج ، بطول قراءة 100 نقطة أساس ، بهدف متوسط 30 مليون قراءة / عينة. قم بمحاذاة علامات قراءة التسلسل مع الجينوم المرجعي المناسب (على سبيل المثال ، hg38) باستخدام bwa (v 0.7.5 أو أعلى) 48 ثم حدد القمم باستخدام MACS (v 2.0.10 أو أعلى) 49 ، مما يسمح بتحديد القمم العريضة (-slocal = 0 ، -llocal = 500000). قم بإنشاء مجموعة مشتركة من المناطق من عينات مختلفة باستخدام أداة BEDTools متعددةالتقاطع 50 ، مما يتيح خيار التجميع. احسب التغطية لكل عينة على قائمة المنطقة النهائية باستخدام multicov الخاص ب BEDTools ، مع تجاهل القراءات المكررة. قم بإجراء تحليل لعدد المصفوفة باستخدام edgeR. ضع مرشحا لا يقل عن عدد واحد لكل مليون (cpm) في ثلاث عينات على الأقل للتخلص من المناطق منخفضة التخصيب.ملاحظة: بدلا من ذلك، يمكن استخدام الدالة filterByExpr في edgeR. تحديد المثيلة التفاضلية من خلال اعتماد النموذج اللوغاريتمي الخطي المعمم المطبق في edgeR (الدالة glmFit) والتطبيع باستخدام التطبيع الكميالشرطي 51 لتصحيح محتوى GC حسب المنطقة. حدد المناطق الميثيلية التفاضلية بتطبيق عتبة 0.01 على قيم p المعدلة BH. قم بإجراء تحليل التسلسلات المتكررة على النحو التالي.ملاحظة: راجع دليل مستخدم edgeR للحصول على القائمة الكاملة للخيارات والمعلمات (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).قم بتصفية نتائج MeDIP-seq لقيمة p اسمية 1 في المجموعة الأولى والمناطق التي تحتوي على logFC <-1 في المجموعة الثانية. استرجع التعليق التوضيحي RepeatMasker للجينوم المختار كملف سرير واحسب عدد العناصر في كل مجموعة. تحويل العدد كنسبة على عدد المناطق لكل مجموعة بيانات. استخرج نسبة الميثيلوم التي تتداخل مع كل فئة من التكرارات وقم بإجراء اختبار كاي تربيع للكشف عن أي تخصيب كبير. قم بتقييم ما إذا كانت المناطق المنسوخة تفاضليا أو الميثيلية التفاضلية بين عينات ETR والعينات المعالجة الوهمية يتم تعيينها في ارتباط gRNA خارج الهدف المتوقع بالسيليكو.استخدم مجموعة تصميم كريسبر52 كأداة تنبؤ ملزمة ل gRNA خارج الهدف. لكل منطقة مفترضة خارج الهدف ، انظر إلى أقرب موقع بدء النسخ (TSS) وأقرب منطقة ميثيلية. ضع في اعتبارك كتأثير حقيقي خارج الهدف منطقة مرتبطة إما بجين منظم ب FDR <0.01 ومسافة إلى TSS أصغر من 10 كيلو بايت ، أو منطقة ميثيلية منظمة ب FDR <0.01 ومسافة أقل من 1 كيلو بايت. حدد عدد وخصائص المناطق التي تم تغييرها نسخيا أو الإفراط في الميثيل في العينات المعالجة بكل من gRNAs الثلاثة الأفضل أداء مقارنة بالعينات المعالجة الوهمية (الشكل 5) لتحديد الأكثر تحديدا بين gRNAs. رتب التأثير المحتمل لموقع خارج الهدف على فسيولوجيا الخلايا المستهدفة بالترتيب التالي (من الأكثر تأثيرا إلى الأقل تأثيرا):ط) الجين المعبر عنه داخل الجينات والمنطقة التنظيمية من الناحية الفسيولوجيةب) الجين داخل الجينات ، المنطقة الخارجية المعبر عنها من الناحية الفسيولوجيةج) الجين المعبر عنه فسيولوجيا داخل الجينات والمنطقة الداخليةد) الجينات داخل الجينات ، المنطقة التنظيمية – غير المعبر عنهاv) الجينات داخل الجينات ، المنطقة الخارجية – غير المعبر عنهاvi) الجين داخل الجينات ، المنطقة الداخلية – غير المعبر عنهاسابعا) المنطقة بين الجينات

Representative Results

عند تسليم نموذج مانح للتكامل بوساطة إعادة التركيب المتماثل للمراسل الفلوري في الموضع المستهدف إلى جانب نظام CRISPR / Cas9 (على سبيل المثال ، عن طريق نواة البلازميد في حالة خلايا K-562) ، تظهر الخلايا الإيجابية للمراسل في العينة المعالجة (الشكل 1 ، أسفل). إذا لم يحدث ذلك، فأعد التحقق من دقة تصميم واستنساخ كل من قالب المتبرع وكواشف كريسبر/كاس9. إذا تم التأكيد ، فحاول تحسين جرعات الكواشف وبروتوكول التسليم نفسه. بمجرد الحصول على خط خلية المراسل ، حدد تسلسل المروج / المحسن للجين المستهدف وصمم لوحة من gRNAs المطابقة. استخدم في أدوات التنبؤ بالسيليكو مثل Chopchop لتحديد تسلسلات gRNA وترتيبها من حيث الكفاءة والنوعية المتوقعة (الشكل 2). إذا لم يتم استرداد gRNAs ، فتحكم في وجود الشكل المجاور للفضاء الأولي Cas9 المتعارف عليه (PAM) (5′-NGG-3′) في التسلسل المستهدف. في حالة عدم وجود تسلسلات PAM ، فكر إما في التحول إلى ETRs بناء على متغيرات Cas9 البديلة المستقلة عن PAM (لم يتم نشر ETRs مع هذه المتغيرات حتى الآن) أو التبديل إلى منصات مجال ربط الحمض النووي البديلة ، مثل ZFPs53 أو TALEs30. ومع ذلك ، إذا تم استرداد gRNAs فقط ذات الفعالية / الخصوصية المتوقعة المنخفضة ، ففكر إما في 1) اختبار gRNAs منخفضة الجودة أو 2) توسيع تسلسل الحمض النووي المستهدف ، بحثا عن gRNAs أفضل. عند التسليم العابر لتركيبة ETR الثلاثية (أو CRISPRoff ؛ v2.1) جنبا إلى جنب مع gRNAs ، قم بإجراء تحليلات قياس التدفق الخلوي الطولي للتعبير عن المراسل الفلوري ، وغالبا ما يلاحظ ذروة قمع المراسلين في التحليلات الحادة ، والتي يتم إعادة امتصاصها جزئيا على الأقل بسبب التخفيف الانقسامي للبلازميدات المشفرة ETR بمرور الوقت (الشكل 4C). إذا كانت تركيبة ETRs / gRNA تودع بشكل فعال مثيلة CpG في الموضع المستهدف ، فسيحدث قمع دائم للمراسل في جزء كبير من الخلايا المعالجة (الشكل 4C). يمكن أن تظهر gRNAs المختلفة كفاءة إسكات متغيرة على المدى الطويل (الشكل 4B ، C). لتقييم الخصوصية على مستوى الجينوم ، استخدم MeDIP-seq لتحديد المناطق الميثيلية التفاضلية بين الخلايا التي كان الهدف فيها خلايا صامتة وغير معالجة على المدى الطويل. من الناحية المثالية ، فإن gRNA المحدد للغاية لن يؤدي إلا إلى ذروة مثيلة CpG الجديدة في الموقع المستهدف (الشكل 5). إذا لم يكن الأمر كذلك ، يمكن للمرء أن يفكر في توصيف النشاط خارج الهدف ل gRNAs المصنفة في موضع أدنى في قائمة الكفاءة على الهدف. الشكل 1: تكامل مراسل tdTomato تحت العناصر التنظيمية لجين B2M البشري عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل. أعلى: مخططات استراتيجية دمج مراسل الفلورسنت tdTomato في أول إنترون لجين B2M البشري عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل الناجم عن كريسبر / كاس9. أسفل: مخططات نقطية تمثيلية لخلايا K-562 قبل وبعد دمج مراسل tdTomato في أول إنترون لجين B2M . الاختصارات: HA = ذراع التماثل ؛ HDR = إصلاح موجه بالتماثل ؛ IRES = موقع دخول الريبوسوم الداخلي ؛ pa = BGH بولي (أ) ؛ SA = موقع متقبل لصق ؛ WT = النوع البري ؛ 3XSTOP = ثلاثة كودونات توقف ترادفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 2: في تحديد السيليكو للحمض النووي الريبي gRNA الذي يستهدف جزيرة CpG لجين B2M ، مرتبة حسب الكفاءة والنوعية المتوقعة. تظهر واجهة إخراج Chopchop gRNAs التي تستهدف جزيرة CpG المضمنة في تسلسل المروج لجين B2M ، مرتبة لكل من عدد التسلسلات خارج الهدف مع عدم تطابق 0 (MM0) أو 1 (MM1) أو 2 (MM2) أو 3 (MM3) والكفاءة المتوقعة على الهدف. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 3: الاستنساخ والنواة المصفوفة ل gRNAs من أجل إسكات التخلق اللاجيني بوساطة dCas9 ETR. الجزء العلوي: استنساخ أولي بوساطة oligo في U6-gRNA بشري يعبر عن البلازميد. أسفل: شاشة مصفوفة من الحمض النووي الريبي gRNA الذي يستهدف B2M لإسكات الجينات اللاجينية القائمة على CRISPR / dCas9 بواسطة نواة البلازميد في خلايا الطماطم K-562B2M / tdTomato . يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 4: فحص gRNAs التي تحفز بشكل فعال إسكات الجين B2M على المدى الطويل. (أ) أعلى: مخططات جينB2M tdTomato الموضحة في المنطقة المتضخمة ، والترتيب النسبي واتجاه ارتباط ETRs المستندة إلى dCas9 المعقدة مع gRNAs. أسفل: مخططات نقطية تمثيلية لخلايا B2MtdTomato K-562 إما قبل (يسار) أو بعد إسكات ETR (يمين). يحلل في 30 يوما بعد النقل مع تشفير البلازميدات ل gRNAs وتركيبة dCas9: KRAB + dCas9: D3A + dCas9: D3L الثلاثي. (ب) إسكات نشاط gRNAs المشار إليه (إما في التجمعات أو كجزيئات gRNA فردية) التي تستهدف جزيرة CpG من B2M (تشير الأسهم الحمراء في المخطط العلوي إلى اتجاه gRNAs) في خلايا الطماطم K-562 B2M tdTomato في اليوم 30 بعد النقل. تظهر البيانات النسبة المئوية للخلايا السلبية للطماطم (متوسط ± SEM ؛ n = أربعة عمليات نقل مستقلة لكل حالة علاجية). (ج) تحليل المسار الزمني لخلايا B2MtdTomato K-562 عند النقل باستخدام البلازميدات التي تعبر عن تركيبة ETR الثلاثية و b2M CpG المشار إليها التي تستهدف الجزيرة gRNAs أو وهمية (gRNA- و ETR-free transfection). تظهر البيانات النسبة المئوية للخلايا السلبية للطماطم (متوسط ± SEM ؛ n = ثلاث عمليات نقل مستقلة لكل حالة علاجية). البيانات غير المنشورة. اللوحتان ألف وباء مقتبسة من Amabile et al.30. الاختصارات: CGI = جزيرة CpG ؛ IRES = موقع دخول الريبوسوم الداخلي ؛ pa = BGH بولي (أ) ؛ SA = موقع متقبل لصق ؛ SD = موقع مانح لصق ؛ TSS = موقع بدء النسخ ؛ UT = غير منقولة ؛ 3XSTOP = 3 كودونات توقف ترادفي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. الشكل 5: تحليل على مستوى الجينوم لخصوصية ETR بواسطة RNA-seq وبواسطة MeDIP-seq. على اليسار: مقارنة مستويات التعبير في خلايا B2MtdTomato K-562 المعالجة والخلايا المعالجة بتركيبة dCas9: KRAB الثلاثية ، dCas9: DNMT3A ، dCas9: DNMT3L ETR ومع gRNA الذي يستهدف جزيرة CpG لجين B2M. يتم التعبير عن القيم في log2 من القراءات لكل كيلوقاعدة لكل مليون (RPKM) من القراءات المعينة. تمثل النقاط السوداء الجينات المعبر عنها بمستويات مماثلة في جميع الظروف. تمثل الدوائر الصفراء الجينات المنظمة تفاضليا بموجب FDR <0.01 ؛ تمثل الدائرة الحمراء نسخة B2M-IRES-tdTomato . أعلى اليمين: مخطط سيرك يعرض ملامح MeDIP-seq للجينوم الكامل لخلايا B2MtdTomato K-562 المعالجة وهمية (زرقاء) أو الخلايا المعالجة بمزيج dCas9: KRAB الثلاثي ، dCas9: DNMT3A ، dCas9: DNMT3L ETR ومع gRNA يستهدف جزيرة CpG (CGI) لجين B2M (أخضر). أسفل اليمين: تظهر حالة مثيلة موضعB2M tdTomato في العينات المشار إليها. يتم تمثيل ثلاث نسخ متماثلة في كل تراكم. تم تنعيم تراكم القراءات المحاذاة باستخدام نافذة غاوسية. تم اقتباس هذا الرقم من Amabile et al.30. الاختصار: TSS = موقع بدء النسخ. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

قد يمثل الإسكات اللاجيني المستهدف حلا واعدا لعلاج الاضطرابات التي يمكن أن تستفيد من التعطيل الدائم للجينات ، بما في ذلك الأمراض الناجمة عن طفرات اكتساب الوظيفة1 ، والأمراض المعدية2 ، والأمراض التي قد يؤدي فيها إسكات أحد الجينات إما إلى تعويض عيب وراثي في جين آخر3 أو إطلاق العنان للإمكانات الكاملة لعلاجات الخلايا بالتبني4 ، 5. من خلال العمل على مستوى الكروماتين والانتشار الذاتي بواسطة الخلية7،30،32 ، يمكن أن يتجنب الإسكات اللاجيني التغيرات السامة (على سبيل المثال ، إعادة ترتيب الكروموسومات) لتسلسل الحمض النووي للجين المستهدف والإسكات الجزئي العابر للهدف ، وهي قيود على اضطراب الجينات الاصطناعية القائمة على النيوكلياز8،34،35 والضربة القاضية القائمة على الحمض النووي الريبي 33 ، على التوالي.

تتمثل إحدى الخطوات الأولية الرئيسية في أي بروتوكول إسكات لاجيني في تحديد الموضع المناسب على الجين المستهدف لتوجيه ETRs التي ستودع العلامات اللاجينية القمعية اللازمة لإيقاف نشاط النسخ للهدف. قد تتفق العناصر التنظيمية المختلفة لبدء النسخ في الموقع القريب والبعيد لدعم ناتج النسخ لجين بشري معين54. علاوة على ذلك ، يمكن الآن تحديد مواقع مستهدفة مختلفة لكل عنصر تنظيمي محدد بفضل العدد المتزايد من تقنيات ربط الحمض النووي القابلة للبرمجة6. لذلك ، يمكن استخدام البروتوكولات ، مثل تلك الموصوفة هنا في خطوط الخلايا المهندسة ، لترشيح المواقع المستهدفة الفردية و / أو المناطق الجينومية القابلة للإسكات اللاجيني بوساطة ETR ، قبل الشروع في جهود تقييم مرهقة وتستغرق وقتا طويلا لأفضل المرشحين في الإعداد العلاجي النهائي. ويرد أدناه وصف إضافي لبعض الجوانب الحاسمة للبروتوكول.

هندسة خط خلية مراسل تنبئ بالهدف العلاجي النهائي
على الرغم من التحسين المستمر لبروتوكولات هندسة الخلايا – المطلوبة هنا لإدخال ترميز الكاسيت للمراسل الفلوري في الجين المستهدف وتسليم ETRs – لا يمكن اعتبار أنها قد تكون متاحة بالفعل لخط الخلية الذي يشبه الهدف العلاجي النهائي أكثر. في هذه الحالة ، يمكن تطبيق استراتيجيات تخفيف مختلفة: أ) الاستفادة من مجموعات التحسين التي يوفرها البائعون لتحسين بروتوكول النقل الداخلي لخط الخلية المستهدف ؛ ب) التحول إلى خطوط خلايا أخرى لا تزال تعبر عن هذا الجين المستهدف ولكنها تنتمي إلى أنسجة أخرى غير الهدف العلاجي النهائي – والتي تم تحسين البروتوكولات الهندسية لها على نطاق واسع. في حالة عدم توفر هذه الخيارات ، يمكن للمرء أن يفكر في التبديل إلى أنواع الخلايا الأولية أو المواد العضوية التي تمثل الهدف النهائي. كاعتبار عام لكل من الدراسات قبل السريرية والتطبيقات العلاجية للإسكات اللاجيني القائم على ETR ، يجب التخلص من السيناريوهات التي يكون فيها الجين المستهدف ضروريا لنوع الخلية المستهدفة. سيؤدي الإسكات الكامل والطويل الأجل لجين أساسي تفرضه ETRs إلى الانتقاء العكسي للخلايا المستهدفة بمرور الوقت (وربما سمية العلاج). وتفضل في هذه الحالات التكنولوجيات البديلة التي توفر إلغاءا جزئيا للهدف، مثل RNAi33.

تقييم نشاط إسكات التقارير الجوية على الهدف
أثبتت ETRs المستندة إلى مزيج من مجالات المستجيب KRAB و DNMT3A و DNMT3L فعاليتها ضد الغالبية العظمى من الجينات المشفرة للبروتين ، مع نافذة استهداف طويلة الأمد تبلغ مساحتها 1 كيلو قاعدة تتمحور حول موقع بدء النسخ32. للتعرف على كيفية ظهور تجربة إسكات جينية جيدة الأداء ، يتم توفير التفاصيل الفنية ونتائج إسكات جين B2M في خلايا K-562 هنا. يمكن اعتبار هذا عنصر تحكم إيجابي مهم يجب تضمينه ليس فقط من قبل الباحثين الذين يعملون مع خلايا K-562 ولكن أيضا من قبل أولئك الذين يقتربون من التكنولوجيا القائمة على ETR لأول مرة. كما هو مذكور في البروتوكول ، يوصى بتعطيل الجينات القائم على النيوكلياز الاصطناعي (على سبيل المثال ، CRISPR / Cas9) كتحكم إضافي في كل من كفاءة توصيل الجينات في نوع الخلية محل الاهتمام والنمط الظاهري للخلايا المحرومة من الجين المستهدف. بعد الشاشة الأولية ل gRNAs التي ستقترن ب ETRs المستندة إلى CRISPR / dCas9 ، إذا لم يكن أي من gRNAs الذي تم اختباره قادرا على إسكات الجين المستهدف بشكل دائم ، فيجب على المرء أن يفكر ، بالترتيب التالي: 1) زيادة كمية gRNAs و ETRs التي يتم تسليمها ؛ 2) اختبار مجمعات من أعلى gRNAs تبحث عن تأثيرات تآزرية بينها. إذا لم يتحقق الإسكات على المدى الطويل ، فيجب على المرء أن يأخذ: 3) اختبار gRNAs إضافية ، والتي قد تستهدف مواقع أكثر صلة بتوجيه الإسكات اللاجيني ؛ 4) التحول إلى منصات DBD المستندة إلى ZFP8 أو TALE9 ، والتي قد يكون لها قدرة ربط محسنة بالكروماتين المستهدف ؛ 5) التحول من عابر إلى مستقر – على سبيل المثال ، دمج التعبير القائم على النواقل الفيروسية ل ETRs (إما gRNA أو تركيبات اندماج dCas9 أو كليهما عند اعتماد تقنية CRISPR / dCas9). نظرا لأن مجموعتنا طورت ، ولديها خبرة قوية في التسليم المشترك لثلاثة ETRs30 منفصلة ، فإن البروتوكول والنتائج الموضحة هنا تستند إلى هذا النهج. ومع ذلك ، يمكن تطبيق سير عمل مفاهيمي مماثل على الأرجح لنظام قائم على كريسبر الكل في واحد32.

تقييم النشاط غير المستهدف للوائح الاتصالات التفاعلية
أظهرت دراسات متعددة مؤشرات أولية في المختبر لخصوصية ETRs بناء على مزيج من مجالات المستجيب KRAB و DNMT3A و DNMT3L30،31،32. ومع ذلك ، إذا لم يظهر أي منها من بين gRNAs التي تم اختبارها ملف تعريف خصوصية مرض من حيث تنظيم النسخ و / أو مثيلة الحمض النووي الجديدة ، فيمكن للمرء اتباع استراتيجيتين غير متعارضتين: أ) تقليل وقت بقاء ETRs داخل الخلية (وبالتالي نشاطها المحتمل خارج الهدف) إما عن طريق تقليل جرعات ETRs أو اختبار أنظمة توصيل بديلة. على سبيل المثال ، مقارنة بالبلازميدات ، من المتوقع أن يقلل كل من mRNA وتوصيل البروتين من وقت تعرض الخلايا ل ETRs ، وبالتالي احتمال النشاط خارج الهدف55 ؛ ب) التحول إلى متغيرات Cas9 الأحدث ، المحسنة لتقليل الارتباط خارج الهدف للمنصة56 ، أو إلى تقنيات ربط الحمض النووي البديلة القائمة على ZFP8 أو TALE9. من المهم مراعاة أنه ، مقارنة بالعينات المعالجة الوهمية ، فإن النشاط المستهدف وغير المستهدف لإسكات الجينات لا يتأثر فقط بارتباط DBD بتسلسلها المستهدف ولكن أيضا بالقدرة المحتملة لمجالات المستجيب اللاجيني على تجنيدها إلى مواقع أخرى بواسطة عواملها المساعدة الطبيعية والداخلية. لذلك ، فإن تقليل وقت بقاء ETRs في الخلية المستهدفة قد يقلل ليس فقط من احتمال ارتباط DBD بمواقع خارج الهدف ، ولكن أيضا من احتمالية تفاعل ETRs مع العوامل المساعدة الداخلية ، مع الفوائد المحتملة من حيث الخصوصية والعيوب من حيث النشاط على الهدف. أخيرا ، بالمقارنة مع العينات المعالجة الوهمية ، يمكن ببساطة اشتقاق بعض تغييرات مثيلة CpG النسخية والأقل احتمالا المقاسة في الخلايا الصامتة عن طريق الحرمان من الجين المستهدف. لا تعتبر هذه الأهداف خارج نطاق تكنولوجيا الإسكات. لتحديدها ، ينبغي للمرء أيضا تضمين اضطراب الجينات بواسطة النيوكلياز الاصطناعي في اللوحة التجريبية8،9،10. سيتم تقاسم التغيرات البيولوجية بسبب الفقدان الوظيفي للجين المستهدف بين الإسكات اللاجيني وهذه التكنولوجيا البديلة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يريد المؤلفون أن يشكروا أنجيلو أمابيل ، وباولا كاباسو ، وإيلاريا كاسيرتا ، وتانيا باكيجا ، وأليس ريشينيا ، وفاليريا موليكا ، وديبورا سيبريا على الجهد التعاوني في تطوير تقنية إسكات الجينات اللاجينية على مر السنين. ديان لازاريفيتش وفرانشيسكا جيانيز لإجراء مراجعة نقدية لتحليلات RNA-seq و MeDIP-seq الموصوفة في البروتوكول. تم دعم هذا العمل من خلال منح إلى A.L. من مؤسسة Telethon (منحة TIGET رقم F1) وبرنامج EU Horizon 2020 (UPGRADE). تم إنشاء الرسوم التوضيحية باستخدام BioRender.com.

مساهمة المؤلفين
ساهم كل من أ. م. و م. أ. و ف. ج. و أ. س. في تصميم البروتوكول وكتابة المخطوطة. وصمم كل من س. ف. و إ. م. و د. س. أقسام المعلوماتية الأحيائية في البروتوكول ونقحوا المخطوطة؛ صمم A.M. و A.L. البروتوكول ، وتصوروا وكتبوا المخطوطة مع مدخلات من جميع المؤلفين.

Materials

4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc
cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc
cccccccccccctctccctcccccccccctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaggccg
gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct
ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg
tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac
cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt
cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg
cgagggcgagggccgcccctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg
cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag
cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa
ggacggcggccactacctggtggagttcaag
accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactactacgtggacaccaagctg
gacatcacctcccacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg
ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc
ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgagggcgagggccgcccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac
caagggcggccccctgcccttcgcctgggac
atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa
ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac
ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg
ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc
cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggcca
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctactact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgaggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc
tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct
ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctggggggtggggtggggcag
gacagcaagggggaggattgggaagacaat
agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat
ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa
tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag
aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat
ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O’leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137 (2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington’s disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -. S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Tags

Epigenetic SilencingGene SilencingArtificial NucleasesEngineered Transcriptional RepressorsChromatin CompactionTranscriptional InhibitionGene DisruptionRNA InterferenceB2M GeneCRISPR Cas9Nucleofection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image