JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Nederlands

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

In vitro Selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren voor gerichte epigenetische uitschakeling

Published: May 05, 2023
doi:
10.3791/64403
, , , , , , ,
1San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy (SR-Tiget),IRCCS San Raffaele Scientific Institute, 2Center for Omics Sciences,IRCCS San Raffaele Institute, 3Institute for Biomedical Technologies,National Research Council, 4Vita-Salute San Raffaele University

Summary

Hier presenteren we een protocol voor de in vitro selectie van gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR’s) met een hoge, langdurige, stabiele, on-target uitschakelingsefficiëntie en een lage genoombrede, off-target activiteit. Deze workflow maakt het mogelijk om een initieel, complex repertoire van kandidaat-ETR’s terug te brengen tot een shortlist, geschikt voor verdere evaluatie in therapeutisch relevante settings.

Abstract

Geninactivatie is van groot belang om de genfunctie te bestuderen en vertegenwoordigt een veelbelovende strategie voor de behandeling van een breed scala aan ziekten. Van de traditionele technologieën lijdt RNA-interferentie onder gedeeltelijke doelopheffing en de vereiste voor levenslange behandelingen. Kunstmatige nucleasen daarentegen kunnen stabiele geninactivatie opleggen door inductie van een DNA-dubbelstrengsbreuk (DSB), maar recente studies twijfelen aan de veiligheid van deze aanpak. Gerichte epigenetische bewerking via gemanipuleerde transcriptionele repressoren (ETR’s) kan een oplossing zijn, aangezien een enkele toediening van specifieke ETR-combinaties kan leiden tot duurzame uitschakeling zonder DNA-breuken te veroorzaken.

ETR’s zijn eiwitten die een programmeerbaar DNA-bindend domein (DBD) bevatten en effectoren van natuurlijk voorkomende transcriptierepressoren. In het bijzonder werd aangetoond dat een combinatie van drie ETR’s uitgerust met het KRAB-domein van humaan ZNF10, het katalytische domein van humaan DNMT3A en humaan DNMT3L, erfelijke repressieve epigenetische toestanden op het ETR-doelgen induceert. Het hit-and-run-karakter van dit platform, het gebrek aan impact op de DNA-sequentie van het doelwit en de mogelijkheid om terug te keren naar de repressieve toestand door DNA-demethylering op aanvraag, maken epigenetische uitschakeling tot een baanbrekend hulpmiddel. Een cruciale stap is het identificeren van de juiste positie van de ETR’s op het doelgen om de uitschakeling op het doel te maximaliseren en de uitschakeling buiten het doelwit te minimaliseren. Het uitvoeren van deze stap in de laatste ex vivo of in vivo preklinische setting kan omslachtig zijn.

Uitgaande van het CRISPR/katalytisch dode Cas9-systeem als paradigmatische DBD voor ETR’s, beschrijft dit artikel een protocol dat bestaat uit de in vitro screening van gids-RNA’s (gRNA’s) gekoppeld aan de triple-ETR-combinatie voor efficiënte on-target uitschakeling, gevolgd door evaluatie van het genoombrede specificiteitsprofiel van tophits. Dit maakt het mogelijk om het initiële repertoire van kandidaat-gRNA’s terug te brengen tot een korte lijst van veelbelovende gRNA’s, waarvan de complexiteit geschikt is voor hun uiteindelijke evaluatie in de therapeutisch relevante setting van belang.

Introduction

Geninactivatie speelt van oudsher een sleutelrol bij het bestuderen van de genfunctie in zowel cellulaire als diermodellen. Bovendien is het in de afgelopen twee decennia, met de opkomst van gentherapie, voorgesteld als een potentieel baanbrekende benadering voor de behandeling van ziekten die worden veroorzaakt door gain-of-function-mutaties1, infectieziekten2 of pathologieën waarbij uitschakeling van het ene gen een erfelijk defect in een ander gen kan compenseren3. Ten slotte is genetische inactivatie van belangrijke regulatoren van celfitness en functionele controle voorgesteld om de efficiëntie van celproducten voor kankerimmunotherapie4 en regeneratieve geneeskunde5 te verbeteren.

Van de verschillende technologieën om geninactivatie te bereiken, is een van de meest veelbelovende gerichte epigenetische uitschakeling 6,7. De kern van deze technologie wordt gevormd door de zogenaamde engineered transcriptional repressors (ETR’s), chimere eiwitten die bestaan uit een programmeerbaar DNA-bindend domein (DBD) en een effectordomein (ED) met epigenetische repressieve functie. Zinkvingereiwitten (ZFP’s)8, transcriptieactivatorachtige effectoren (TALE’s)9 of op CRISPR/dCas910 gebaseerde DBD’s kunnen worden ontworpen om de ED selectief te binden aan de promotor/enhancer-sequentie van het doelgen dat tot zwijgen moet worden gebracht. Eenmaal daar voert de ED van de ETR zijn uitschakelactiviteit uit door heterochromatine-inducerende repressieve epigenetische markeringen op te leggen, zoals histonmodificaties (H3K9 11,12 of H3K27 13-methylering, H3- of H4-deacetylering 14) en CpG-DNA-methylering 15, afhankelijk van het gebruikte repressieve domein.

In het bijzonder is, geïnspireerd door de moleculaire processen van permanente transcriptionele onderdrukking van endogene retrovirussen die plaatsvinden in het pre-implantatie-embryo16, een combinatie van drie ETR’s gegenereerd om de volgende ED’s te exploiteren: i) het Krüppel-associated box (KRAB)-domein van menselijk ZNF10; ii) het katalytische domein van humaan de novo DNA-methyltransferase 3A (DNMT3A); en iii) de volledige lengte humaan DNA methyltransferase 3-like (DNMT3L). KRAB is een geconserveerd repressief domein dat wordt gedeeld door verschillende ZFP’s in hogere gewervelde dieren17,18, waarvan de uitschakelactiviteit voornamelijk gebaseerd is op het vermogen om KAP1 19 te rekruteren – een steigereiwit dat vervolgens interageert met verschillende andere heterochromatine-inductoren20 – bestaande uit het nucleosoomremodellerings- en deacetyleringscomplex (NuRD) 21, het H3K9-histonmethyltransferase SETDB122 en de H3K9-methylatielezer HP1 23, 24, onder andere.

DNMT3A draagt actief methylgroepen over op het DNA bij CpG-sequenties25. De katalytische activiteit van DNMT3A wordt versterkt door de fysische associatie met DNMT3L, een door embryo’s en kiemcellen beperkte paraloog van DNMT3A die het katalytische domein mist dat verantwoordelijk is voor de overdracht van methylgroepen26,27. DNA-methylatie in CpG-rijke regio’s – aangeduid als CpG-eilanden (CGI’s) – ingebed in de promotor/enhancer-elementen van zoogdiergenen wordt meestal geassocieerd met transcriptie-uitschakeling28. Belangrijk is dat CpG-methylering, eenmaal afgezet, stabiel kan worden overgeërfd tijdens de mitose door een op UHRF1-DNMT1 gebaseerd moleculair complex29.

Stabiele overexpressie van de ETR’s in de doelcel kan problematisch zijn, waarschijnlijk vanwege de toenemende risico’s van off-target activiteit en het onderdrukken van endogene interactoren van hun fysiologische doellocaties in de loop van de tijd. Voorbijgaande expressie van enkelvoudige ETR-groepen kan echter niet leiden tot langdurige uitschakeling met een hoog rendement30, waardoor hun therapeutische toepassing wordt belemmerd. Daarom was een baanbrekende doorbraak in het veld het bewijs dat de combinatie van de drie op KRAB-, DNMT3A- en DNMT3L-gebaseerde ETR’s synergie kan opleveren en, zelfs wanneer ze slechts tijdelijk gelijktijdig worden toegediend, de promotorsequentie van het doelgen H3K9 en CpG-methylering kan opleggen. Deze worden vervolgens gelezen en gepropageerd door de cel tijdens de mitose, wat leidt tot erfelijke uitschakeling in meerdere menselijke en muizencellijnen, evenals ex vivo gekweekte primaire cellen30.

Merk op dat de epigenetische uitschakeling die door de ETR’s wordt opgelegd, op verzoek kan worden teruggedraaid door gerichte (bijv. rekrutering van de op CRISPR/dCas9 gebaseerde TET1 DNA-demethylase op de tot zwijgen gebrachte locus) of farmacologische (toediening van de DNA-methyltransferaseremmer 5-Aza) DNA-demethylering30, een potentieel tegengif in geval van ETR-gerelateerde bijwerkingen. Alles-in-één ETR’s met de drie op KRAB, DNMT3A en DNMT3L gebaseerde ED’s werden ook beschreven, die significante uitschakelrendementen vertoonden in cellijnen31,32 tegen de grote meerderheid van eiwitcoderende genen. Bovendien rapporteerden verschillende onderzoeken waarbij de ETR’s werden gebruikt een hoog veiligheidsprofiel, zonder grote off-target activiteit in termen van de novo CpG-methylering of verandering van de toegankelijkheid van chromatine30,31,32. Vóór klinische toepassingen wordt echter een specifieke analyse aanbevolen van het specificiteitsprofiel van ETR’s die zijn uitgerust met een nieuw ontworpen DBD.

Vanuit een klinisch perspectief kan gerichte epigenetische uitschakeling cruciale voordelen bieden voor zowel RNA-interferentie (RNAi)-gebaseerde knockdown33 als kunstmatige nuclease-gebaseerde gendisruptie8. In tegenstelling tot RNAi kan gerichte epigenetische uitschakeling leiden tot volledige opheffing van het doelwit per cel en is er geen periodieke behandeling nodig om langdurige uitschakeling te garanderen; in tegenstelling tot genverstoring laat het de DNA-sequentie ongewijzigd, waardoor het genereren van DNA-dubbelstrengsbreuken (DSB’s) wordt vermeden. DSB’s kunnen dan apoptose en stilstand van de celcyclus induceren, wat mogelijk kan leiden tot een selectie tegen cellen met een functionele p53-route 34,35 en, vooral in multiplex-genbewerkingsomgevingen, chromosomale herschikkingen35. Bovendien kan gendisruptie, door het doorgeven van de onomkeerbare mozaïekuitkomst van niet-homologe-eind-joining-gemedieerde DNA DSB-reparatie36 niet voorkomen dat het doelwit in het frame wordt gerepareerd in functionele coderende sequenties als een van de uiteindelijke uitkomsten en, in tegenstelling tot epigenetische uitschakeling, kan het niet op verzoek worden gewist.

Ten slotte heeft epigenetische uitschakeling het potentieel om het bereik van richtbare genetische elementen uit te breiden naar klassen die geheel of gedeeltelijk refractair zijn voor RNAi en genverstoring, zoals niet-getranscribeerde regulerende elementen en niet-coderende RNA’s30,32. De eerste cruciale stap voor elke gerichte epigenetische uitschakelingstoepassing is het ontwerpen van een panel van ETR’s die de verschillende regulerende sequenties van het doelgen bestrijken en de best presterende identificeren. Het aantal te testen ETR’s kan van cruciaal belang zijn, gezien het toenemende deel van het genoom dat het doelwit kan zijn van de programmeerbare DNA-bindingstechnologieën die voortdurend in ontwikkeling zijn37. Het uitvoeren van de screening van de ETR’s rechtstreeks op het celtype waarin het doelgen therapeutisch tot zwijgen kan worden gebracht, zou de meest relevante optie zijn. Schermen met een hoge doorvoer kunnen echter technisch omslachtig zijn in primaire cellen vanwege hun beperkte overleving in kweek en hun vaak suboptimale engineeringcapaciteit. Grootschalige schermen kunnen in vivo nog onhaalbaarder zijn.

Een praktischer alternatief bestaat erin om eerst een eerste screening uit te voeren van een groot panel van ETR’s in gemakkelijk te engineeren cellijnen, en vervolgens alleen de meest veelbelovende te valideren in het therapeutisch relevante celtype. Een parallel probleem is de selectie van een geschikte uitlezing om de uitschakelingsefficiëntie van de ETR’s te meten. Het rechtstreeks beoordelen van de transcript- of eiwitniveaus van het doelgen door middel van RT-qPCR, western blot of ELISA kan kostbaar en tijdrovend zijn en kan onvoldoende gevoeligheid hebben, waardoor de toepassing ervan op hoge doorvoerschalen wordt beperkt. Het genereren van ad hoc gemanipuleerde reportercellijnen waarin een fluorofoor onder de transcriptionele controle van de regulerende sequenties van het doelgen wordt geplaatst, maakt het mogelijk om gebruik te maken van de op flowcytometrie gebaseerde benadering om epigenetische uitschakeling te lezen op het niveau van één cel en in een hoog doorvoertempo.

In navolging van deze algemene beschouwingen beschrijft dit artikel een protocol dat bestaat uit de in vitro arrayed screening van ETR’s voor on-target uitschakelingsefficiëntie, gevolgd door evaluatie van de genoomwijde off-target activiteit van de top hits. Deze workflow maakt het mogelijk om het initiële repertoire van kandidaat-ETR’s terug te brengen tot een korte lijst van veelbelovende ETR’s, waarvan de complexiteit geschikt is voor hun uiteindelijke evaluatie in het therapeutisch relevante celtype van belang.

Van de verschillende programmeerbare DBD’s die kunnen worden gebruikt om ETR’s te genereren, zal dit protocol zich richten op de op CRISPR/dCas9 gebaseerde technologie, vanwege het gemak van het ontwerpen van gRNA’s die de doelgenpromotor op een hoge doorvoerschaal overspannen. Dezelfde conceptuele workflow die hieronder wordt beschreven, kan echter worden gebruikt om de efficiëntie en specificiteit van ETR’s die zijn uitgerust met andere DBD’s te evalueren.

Protocol

1. Engineering van een op fluorescentie gebaseerde reportercellijn om de transcriptionele activiteit van het doelgen te monitoren door middel van flowcytometrie Identificeer cellijnen die het doelgen tot expressie brengen dat tot zwijgen moet worden gebracht. Blader door het doelgen dat tot zwijgen moet worden gebracht in de Human Protein Atlas38 en navigeer door de sectie “Cellijn” om die lijnen te identificeren die representatief zijn voor het somatische weefsel van belang (bijv. een levercellijn als de uiteindelijke doelen leverhepatocyten zijn). U kunt ook een openbaar beschikbare RNA-sequencing (RNA-Seq)-database ondervragen (bijv. NCBI GEO). Geef onder de kandidaten prioriteit aan cellijnen waarvoor efficiënte protocollen voor voorbijgaande genafgifte – instrumenteel voor ETR-afgifte – beschikbaar zijn.OPMERKING: Van de verschillende modaliteiten is nucleofectie een van de beste opties, omdat het zorgt voor een hoge transfectie-efficiëntie. Hier zijn menselijke erytroleukemie K-562-cellen gekozen om een cellijn te genereren die de transcriptionele activiteit van het bèta-2-microglobuline (B2M)-gen rapporteert (hierna aangeduid als de B2MTdTomato K-562-cellen). Geef verder prioriteit aan de kandidaten om cellijnen te vermijden waarin het doelgen essentieel is voor de levensvatbaarheid van de cel, omdat dit het onderhoud van cellen schaadt met stabiele uitschakeling van het doelgen in kweek. Indien niet eerder gerapporteerd, om een idee te hebben van de essentie van het doelgen in het celtype van keuze, genereert u een genetische verstoringscontrole door de cellen te transfecteren met Cas9-nuclease en een gRNA dat zich richt op een van de eerste coderende exonen van het gen.OPMERKING: Genetische disruptie is per definitie een stabiele gebeurtenis; Tegenselectie van verstoorde cellen in de loop van de tijd geeft aan dat het doelgen essentieel is voor de fysiologie van de geselecteerde cel.Identificeer de isovorm van de doelsplitsing die bij voorkeur wordt gebruikt in de geselecteerde cellijn (de isovorm NM_004048.4 van het B2M-gen is het doelwit in dit protocol). Identificeer een gRNA dat effectief en specifiek kan knippen in het eerste coderende exon van de doelisovorm (bijv. Chopchop (http://chopchop.cbu.uib.no/)39, een valide en gebruiksvriendelijke online gRNA-selectietool). Transfecteer voor K-562-cellen 1 μg spCas9-coderend plasmide (hCas9; zie materiaaltabel) en 250 ng gRNA-coderend plasmide (phU6-gRNA; zie materiaaltabel) per 5 × 105 cellen door middel van nucleofectie (volgens de instructies van de fabrikant). Kweek de cellen (K-562-cellen bij 37 °C onder 5% CO2 in RPMI-1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum [FBS], L-glutamine en penicilline/streptomycine [100 E/ml]) en controleer de niveaus van genverstoring in de loop van de tijd door gebruik te maken van een mutatiedetectiekit (volg de instructies van de fabrikant). Kloon een donorsjabloon voor homologe recombinatie-gemedieerde integratie van een fluorescerende reporter onder de transcriptionele controle van het doelgen van belang (Figuur 1).Identificeer het gebied van het doelgen om de fluorofoorexpressiecassette te integreren.OPMERKING: Vermijd het richten op transcriptioneel relevante elementen, zoals CpG-eilanden en regio’s die zijn verrijkt voor H3K27-acetylering (marker van actieve promotors en enhancers). Het veranderen van deze regulerende elementen (potentieel belangrijk om door de ETR’s te worden aangevallen om epigenetische uitschakeling te instrueren) maakt de reportercellijn minder voorspellend voor de fysiologische regulatie van het doelgen.Als het doelgen niet codeert voor een uitgescheiden eiwit, fuseer de reporter dan met het laatste codon van het doelgen via een 2A zelfsplitsend peptide om de functionaliteit van het doelgen te behouden. Als het doelgen codeert voor een uitgescheiden eiwit, plaats de reporter dan in een intronisch gebied van het doelgen om mogelijke secretie van de reporter te voorkomen. Force-integratie van de reporter in het gesplitste transcript via een splice-acceptorplaats (SA) en daaropvolgende vertaling via een interne ribosoom-ingangssequentie (IRES) schaadt de functionaliteit van het doelgen. Gebruik Chopchop om gRNA-knippen in het doelgebied te selecteren (hier wordt een gRNA geselecteerd om zich te richten op de sequentie 5′-AGGCTACTAGCCCCATCAAGAGG-3′ van het eerste intron van het B2M-gen ). Ontwerp een donorsjabloon voor de gRNA-snijplaats bestaande uit: i) een linker homologie-arm (n basenparen [bp] die overeenkomen met het gebied net stroomopwaarts van de gRNA-snijplaats); ii) een promotorvrije transgenexpressiecassette (in het hier getoonde geval een SA-3X Stop Codon-IRES-tdTomato-BGH poly(A) die de voorkeur geeft aan splitsing met het eerste intron van het B2M-gen ); en iii) een rechter homologie-arm (n bp die overeenkomt met het gebied stroomafwaarts van de gRNA-snijplaats).OPMERKING: De lengte van de homologiearmen die nodig zijn om homologe recombinatie effectief te induceren, kan variëren tussen verschillende celtypen (100-500 bp is een geschikt bereik voor K-562-cellen). Lever het CRISPR/Cas9-nucleasesysteem en het donorsjabloon binnen de doelcellijn. Transfecteer voor K-562-cellen 1 μg spCas9-coderend plasmide (hCas9; zie Tabel met materialen), 250 ng gRNA-coderend plasmide (phU6-gRNA; zie Tabel met materialen) en 1 μg donorsjablooncoderend plasmide per 5 × 105 cellen via nucleofectie (volgens de instructies van de fabrikant). Kweek de cellen gedurende ten minste 14 dagen (voor K-562-cellen) en controleer de expressieniveaus van de fluorescerende reporter in de loop van de tijd met behulp van een flowcytometer (activeer het phycoerythrin (PE)-kanaal om de fluorescentie-intensiteit van de tdTomato-reporter te meten en volg de instructies van de fabrikant om flowcytometrie uit te voeren).OPMERKING: De donorsjabloon – vooral als deze op plasmide is gebaseerd – kan cryptische promotorsequenties bevatten, wat leidt tot de expressie van de fluorescerende reporter uit niet-geïntegreerde donorkopieën. Het kweken van de cellen maakt verdunning van deze niet-geïntegreerde kopieën door celdeling mogelijk en uiteindelijk behoudt de expressie van de reporter alleen van de donorkopieën die in het doelgenoom zijn geïntegreerd. Kloon reporter-positieve cellen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) op het niveau van één cel. Activeer voor dit protocol het PE-kanaal om de fluorescentie-intensiteit van de tdTomato-reporter te meten en volg de instructies van de fabrikant om enkele tdTomato-positieve K-562-cellen per putje van een plaat met 96 putjes te sorteren. Na celexpansie in kweek (meestal 20-30 dagen voor K-562-cellen), screent reporter-positieve klonen door PCR om er een te selecteren met een bi-allelische integratie van de reportercassette in de doellocus.OPMERKING: Dit maximaliseert de expressie van de verslaggever en vergemakkelijkt verdere oplossing tussen cellen die de verslaggever tot expressie brengen en cellen die door de verslaggever tot zwijgen worden gebracht door middel van flowcytometrie na ETR-behandeling.Genoom-DNA extraheren uit 1 × 105 cellen per reporter-positieve kloon met behulp van een DNA-extractiekit (volgens de instructies van de fabrikant). Amplificeer het B2M-doelgebied met voorwaartse (5′-GTATTTGCTGGTTATGTTAG-3′) en achterwaartse (5′-AATGGTTGAGTTGGAC-3′) primers volgens de instructies van de PCR-amplificatiekit. De gloeitemperatuur voor dit paar primers is 47,7 °C met op Taq gebaseerde DNA-polymerasen en 0,5 μM primerconcentraties. Analyseer het PCR-product met behulp van 1% agarosegelelektroforese (volgens de instructies van de fabrikant). Scherm voor klonen met de band gerelateerd aan de integratie van de tdTomato in de B2M-doellocus (3.413 bp), zonder de band gerelateerd aan de wild-type doellocus (1.027 bp). 2. Ontwerpen van gRNA’s voor CRISPR/dCas 9-gebaseerde epigenetische uitschakeling van het doelgen Blader door het doelgen in de UCSC-genoombrowser40 en extraheer de nucleotidesequentie van regio’s die mogelijk de transcriptionele activiteit reguleren, zoals CpG-eilanden en locaties die zijn verrijkt voor H3K27-acetylering (marker van actieve promotors en enhancers).OPMERKING: Volgens een recente studie is het beste targetinggebied een venster van 1 kilobase (kb) gecentreerd op de transcriptiestartplaats van het doelgen32. Plak de geselecteerde sequenties in de Chopchop online tool en selecteer repressie als doel van de op te halen gRNA’s. Wacht tot Chopchop een lijst met gRNA’s geeft die in kaart zijn gebracht op de genetische sequentie van belang en worden vermeld volgens een score die rekening houdt met zowel het aantal off-target matches als de voorspelde on-target efficiëntie (Figuur 2). Selecteer ten minste 10 gRNA’s per doelsequentie. Probeer, indien mogelijk, gRNA’s te selecteren die zich over de hele regio uitstrekken om te worden ondervraagd, zonder volledige overeenkomsten met andere intragene sequenties in het hele genoom. 3. Geregelde transiënte toediening van op CRISPR/dCas 9 gebaseerde ETR’s in de reportercellijn Kies uit de eerder gerapporteerde transgenafgiftesystemen voor de doelcellijn die alleen voorbijgaande transgenexpressie toestaan, de afgifte-efficiëntie maximaliseren en de toxiciteit in verband met celmanipulatie minimaliseren. In het geval van K-562-cellen worden zowel plasmide- als mRNA-nucleofectie sterk aanbevolen, waarbij plasmideproductie een technisch eenvoudiger en goedkoper alternatief is. Kloon zowel de gRNA’s geselecteerd in sectie 2 als de op CRISPR/dCas9 gebaseerde ETR’s in het transgenafgiftesysteem naar keuze. Zie de volgende stappen voor een protocol voor het klonen van de ETR’s in plasmide-DNA’s.OPMERKING: Plasmiden die afzonderlijk coderen voor dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A en dCas9:DNMT3L30 zijn niet beschikbaar op Addgene. Ze werden gekloond door de VP160-transactivator van het plasmide pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression41 (zie Materiaaltabel) te vervangen door de KRAB-, DNMT3A- of DNMT3L-domeincoderingssequentie30. Er is een plasmidecodering beschikbaar voor een alles-in-één ETR, genaamd CRISPRoff-v2.132 (zie Materiaaltabel).Transformeer plasmiden die coderen voor de ETR’s in chemisch competente E. coli-cellen (volgens de instructies van de fabrikant). Screen de kolonies op de aanwezigheid van het ETR-dragende plasmide door middel van restrictie-enzymvertering en Sanger-sequencing, en kies ten slotte een van de positieve kolonies voor de productie van plasmide-DNA Midiprep (volgens de instructies van de fabrikant). Kloon de gRNA’s in de phU6-gRNA-ruggengraat (Figuur 3).Voeg met behulp van ontwerpsoftware voor moleculaire biologie een 5′-CACCG-3′-sequentie stroomopwaarts van de protospacer toe (de eerste variabele 20 nucleotiden [nt] van het geselecteerde gRNA) om een 25 nt-lange oligo in silico te genereren, aangeduid als SGfw. Voeg op dezelfde manier een 5′-AAAC-3′-sequentie toe stroomopwaarts van het omgekeerde complement van de protospacer van het geselecteerde gRNA en een 5′-C-3′ stroomafwaarts ervan om een 25 nt-lange oligo te genereren die SGrv wordt genoemd. Bestel zowel de SGfw- als de SGrv-sequentie als zoutvrije enkelstrengs DNA-oligo’s, geresuspendeerd in water van 100 μM. Voeg 1 μL van elke oligo toe aan 2 μL gloeibuffer (10 mM Tris [pH 7,5-8,0], 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) en 16 μL water. Voer oligogloeien uit door de oplossing in een thermocycler te plaatsen die is geprogrammeerd om gedurende 10 minuten bij 95 °C te starten. Koel vervolgens geleidelijk af tot 25 °C gedurende 45 min. Verdun 1 μL van de gegloeide oligo’s met 99 μL nucleasevrij water en ligate vervolgens 1 μL van deze verdunning met 50 ng phU6-gRNA-plasmide dat eerder is verteerd met het BsaI-restrictie-enzym (volg de instructies van leveranciers van BsaI- en ligasekits voor de verterings- en ligatieprocedure). Transformeer 20 μl chemisch competente E. coli-cellen met 2 μl van het ligatieproduct (volg de instructies van de fabrikant voor de transformatieprocedure). Kies meerdere kolonies voor plasmide-DNA Miniprep-productie (volg de instructies van de verkoper) en controleer het succesvol klonen van de protospacer door Sanger-sequencing met de volgende primer die overeenkomt met de U6-promotor 5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3′. Kies een van de positieve kolonies voor de productie van plasmide-DNA Midiprep (volgens de instructies van de fabrikant). Lever de geselecteerde gRNA’s en op CRISPR/dCas9 gebaseerde ETR’s in de reportercellijn in array (één specifiek gRNA per aandoening) (Figuur 3).OPMERKING: Als representatief geval wordt de workflow voor de nucleofectie van plasmiden die coderen voor dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L en gRNA’s gericht op het B2M CpG-eiland in B2M TdTomato K-562-cellen weergegeven in de volgende stappen.Maak afzonderlijke buisjes met 500 ng van elk van de dCas9:KRAB-, dCas9:DNMT3A- en dCas9:DNMT3L-coderende plasmiden, maar verschillend voor het te testen gRNA (125 ng van een gRNA-coderend plasmide per buisje). Voeg een gRNA- en ETR-vrije nucleofectieconditie toe als nagebootst monster. Voer het scherm uit met ten minste drie technische replicaten per monster. Pellet 5 × 105 B2MTdTomato K-562 cellen per buis en nucleofecteer ze met het plasmidemengsel (volgens de instructies van de fabrikant). Resuspendeer de cellen in 200 μL eerder opgewarmde RPMI-1640 zoogdiercelkweekmedia en plaats ze terug in de incubator. 4. Analyse van de transcriptionele activiteit van het doelgen in de loop van de tijd Gebruik flowcytometrie om het percentage tot zwijgen gebrachte cellen op verschillende tijdstippen na toediening van de ETR’s te meten (Figuur 4). Gebruik wild-type (WT) cellen – niet met de fluorofoor-coderende sequentie – om de drempel van reporter-negatieve cellen in te stellen. Gebruik het nep-behandelde monster om de poort in te stellen voor reporter-positieve cellen.OPMERKING: Zoals voorgesteld in stap 1.3, moet u een genetische verstoringscontrole in het experiment opnemen. Dit kan nuttig zijn om zowel de efficiëntie van de CRISPR-afgifte als de fitheid van cellen zonder het doelgen te monitoren; Het verlies van zowel transcriptionele uitschakeling als genetische disruptie in de loop van de tijd kan worden toegeschreven aan de essentie van het doelgen in het celtype van keuze. Neem zowel korte (dag 3, dag 7, dag 10) als lange termijn (dag 21, dag 35) tijdstippen op om een indicatie te krijgen van zowel de acute als de lange termijn efficiëntie van het uitzetten van het uitschakelen. Identificeer de top drie gRNA’s in termen van uitschakeling op lange termijn. Gebruik FACS om de reporter-negatieve subpopulatie te selecteren die stabiel wordt gehandhaafd in die steekproeven. Voer ook FACS uit van de bulkmonsters die een schijnbehandeling hebben ondergaan om ze onder dezelfde behandeling te houden als de testmonsters, zodat ze in de volgende analyses goed kunnen worden vergeleken. 5. Evaluatie van de specificiteit van de ETR-behandeling door RNA-seq en gemethyleerde DNA-immunoprecipitatie (MeDIP)-seq Gebruik RNA-seq om eventuele genoombrede transcriptionele deregulatie bij ETR-levering te evalueren.Voor zowel de door de verslaggever tot zwijgen gebrachte subpopulatie van de monsters die zijn behandeld met de drie best presterende gRNA’s als de nagebootste cellen, extraheer RNA met behulp van in de handel verkrijgbare kits. Beoordeel de kwaliteit en concentratie van het RNA met behulp van in de handel verkrijgbare kits. Voer RNA-fragmentatie, retrotranscriptie en bibliotheekvoorbereiding uit met behulp van in de handel verkrijgbare kits voor de voorbereiding van RNA-seq-bibliotheken (volgens de instructies van de fabrikant). Voer bibliotheekkwantificering en kwaliteitscontrole uit met behulp van kwaliteitscontrole-instrumenten die compatibel zijn met sequencing van de volgende generatie en digitale elektroforese. Sequentiebibliotheken op een sequencer van de volgende generatie volgens de instructies van de fabrikant, met een paired-end protocol van 100 bp en gericht op een gemiddelde van 45 M reads/sample. Stem leestags af op het juiste referentiegenoom en kwantificeer de transcriptie-expressie. Voer uitlijning uit op de tdTomato-sequentie en kwantificeer deze afzonderlijk.OPMERKING: Hier wordt STAR-aligner (v 2.3.0)43 gebruikt, met standaardparameters, gekoppeld aan Rsubread-pakket44. Voer een analyse uit van de RNA-seq-gegevens volgens gepubliceerde best practices45.OPMERKING: Het R/Bioconductor-pakket edgeR46 wordt hier gebruikt, waarbij een filter van ten minste één telling per miljoen (cpm) in ten minste drie monsters wordt toegepast om genen met een lage expressie weg te gooien. Als alternatief kan de functie filterByExpr in edgeR worden gebruikt. Evalueer differentiële genexpressie met behulp van een negatief binomiaal gegeneraliseerd log-lineair model geïmplementeerd edgeR (functie glmFit)47. Stel een drempelwaarde van 0,01 in voor aangepaste p-waarden (Benjamini-Hochberg [BH]-correctie) om differentieel gereguleerde genen te behouden. Evalueer elke eventuele off-target CpG-methylatieactiviteit van de ETR’s door MeDIP-seq.Voor zowel de door de verslaggever tot zwijgen gebrachte subpopulatie van de monsters die zijn behandeld met de top drie gRNA’s als de nep-behandelde cellen, extraheert u genomisch DNA met behulp van in de handel verkrijgbare kits (volgens de instructies van de fabrikant). Soneer 500 ng genoom-DNA met behulp van een ultrasoonapparaat en de volgende parameters: Plicht: 20 %; PIP: 175; Cycli per burst: 200; Tijd: 40 s. Bereid sequencingbibliotheken voor met de in de handel verkrijgbare kits voor MeDIP-seq (volgens de instructies van de fabrikant). Kwantificeer bibliotheken na de stap van de afbinden van de adapter met behulp van een fluorometrische test en controleer de ligatie-efficiëntie met qPCR met behulp van in de handel verkrijgbare kwantificeringskits voor bibliotheken (volgens de instructies van de fabrikant). Verkrijg bibliotheekpools door willekeurig geselecteerde bibliotheken te combineren om technische vooroordelen te verminderen. Gebruik een gelijk bibliotheekbedrag (ng) voor elke bibliotheek om de pools in evenwicht te brengen. Voeg aan elke pool het gemethyleerde en niet-gemethyleerde spike-in-controle-DNA toe dat in de kit zit. Bewaar voor controledoeleinden een volume van 10% van de bibliotheek, gelabeld als “input” en niet immunoprecipiteerd. Voer immunoprecipitatie uit op de resterende 90% van de bibliotheek met behulp van het monoklonale antilichaam gericht tegen 5-methylcytosine in de MeDIP-seq-kit. Zuiveren verrijkte en invoerbibliotheken met behulp van de kits voor zuivering van het 5-methylcytosine-immunoprecipitatieproduct, volgens de instructies van de fabrikant. Evalueer de verrijkingsefficiëntie door kwantitatieve real-time PCR uit te voeren op de interne piek in controles met behulp van primers die bij de kit worden geleverd. Bereken voor elke immunoprecipitatie (IP) de verrijkingsspecificiteit van de terugwinning van gemethyleerd en niet-gemethyleerd DNA, met behulp van de cyclusdrempelwaarden (Ct) van MeDIP en inputfracties verkregen uit de qPCR-reactie (zie vergelijkingen 1 en 2): (1) (2)OPMERKING: Beschouw IP-bibliotheken als succesvol als de specificiteitswaarden ≥0,95 zijn. Versterk de bibliotheken met behulp van MeDIP-seq-bibliotheekvoorbereidingskits, volgens de instructies van de fabrikant, en voer kwantificering en analyse van de verdeling van de bibliotheekgrootte van het product uit. Voer library sequencing uit op sequencers van de volgende generatie. Gebruik paired-end sequencing, met een leeslengte van 100 bp, gericht op een gemiddelde van 30 M reads/sample. Stem de sequentieleestags af op het juiste referentiegenoom (bijv. hg38) met behulp van bwa (v 0.7.5 of hoger)48 en identificeer vervolgens pieken met behulp van MACS (v 2.0.10 of hoger)49, waardoor brede pieken kunnen worden geïdentificeerd (-slocal = 0,-llocal = 500000). Maak een gemeenschappelijke set regio’s uit verschillende steekproeven met behulp van de multiintersection tool50 van BEDTools, waardoor de clusteringoptie wordt ingeschakeld. Bereken de dekking per steekproef over de uiteindelijke regiolijst met behulp van multicov van BEDTools, waarbij dubbele lezingen worden weggegooid. Voer een analyse uit van het aantal matrijzen met behulp van edgeR. Pas een filter toe van ten minste één telling per miljoen (cpm) in ten minste drie steekproeven om laagverrijkte gebieden te verwijderen.OPMERKING: Als alternatief kan de functie filterByExpr in edgeR worden gebruikt. Identificeer differentiële methylering door het gegeneraliseerde log-lineaire model toe te passen dat is geïmplementeerd in edgeR (functie glmFit) en te normaliseren met behulp van voorwaardelijke kwantielnormalisatie51 om te corrigeren voor regiogewijze GC-inhoud. Selecteer differentieel gemethyleerde regio’s door een drempelwaarde van 0,01 toe te passen op BH-gecorrigeerde p-waarden . Voer de analyse van herhaalde sequenties als volgt uit.NOTITIE: Raadpleeg de edgeR-gebruikershandleiding voor de volledige lijst met opties en parameters (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html).Filter de MeDIP-seq-resultaten op een nominale p-waarde 1 in de eerste set en regio’s met logFC <-1 in de tweede set. Haal de RepeatMasker-annotatie voor het gekozen genoom op als een bedbestand en tel het aantal elementen in elke set. Converteer het aantal als een verhouding over het aantal regio’s voor elke gegevensset. Extraheer de verhouding methyloom die elke klasse van herhalingen overlapt en voer een Chi-kwadraattest uit om een significante verrijking te detecteren. Evalueer of differentieel getranscribeerde of differentieel gemethyleerde regio’s tussen ETR- en nepbehandelde monsters in kaart komen met in silico-voorspelde off-target gRNA-binding.Gebruik CRISPR-ontwerpsuite52 als de off-target gRNA-bindingsvoorspellingstool. Kijk voor elke vermeende off-target regio naar de dichtstbijzijnde transcriptie startplaats (TSS) en de dichtstbijzijnde gemethyleerde regio. Beschouw als een echt off-target effect een regio die geassocieerd is met een gen dat wordt gereguleerd met FDR <0,01 en een afstand tot TSS kleiner dan 10 Kb, of een gemethyleerd gebied dat wordt gereguleerd met FDR <0,01 en een afstand kleiner dan 1 Kb. Identificeer het aantal en de kenmerken van de regio’s die transcriptioneel zijn veranderd of overgemethyleerd in monsters die zijn behandeld met elk van de drie best presterende gRNA’s in vergelijking met nep-behandelde monsters (Figuur 5) om de meest specifieke onder de gRNA’s te identificeren. Rangschik de potentiële impact van een off-target site op de fysiologie van de doelcellen in de volgende volgorde (van de meest impactvolle naar de minder impactvolle):i) Intrageen, regulerend regio-fysiologisch tot expressie gebracht genii) Intrageen, exonisch regio-fysiologisch tot expressie gebracht geniii) Intragene, intronische regio-fysiologisch tot expressie gebrachte geniv) Intrageen, regulerend regio-niet tot expressie gebracht genv) Intrageen, exonisch regio-niet-expressief genvi) Intrageen, intronisch regio-niet tot expressie gebracht genvii) Intergene regio

Representative Results

Na levering van een donorsjabloon voor homologe recombinatie-gemedieerde integratie van de fluorescerende reporter in de doellocus gekoppeld aan het CRISPR/Cas9-systeem (bijv. door plasmide-nucleofectie in het geval van K-562-cellen), verschijnen reporter-positieve cellen in het behandelde monster (Figuur 1, onder). Als dit niet het geval is, controleer dan opnieuw de nauwkeurigheid van het ontwerp en het klonen van zowel het donorsjabloon als de CRISPR/Cas9-reagentia. Probeer, indien bevestigd, de doses reagentia en het toedieningsprotocol zelf te optimaliseren. Zodra de reportercellijn is verkregen, selecteert u promotor/enhancer-sequenties van het doelgen en ontwerpt u een panel van overeenkomende gRNA’s. Gebruik in silico voorspellingstools zoals Chopchop om zowel de gRNA-sequenties te identificeren als ze te rangschikken in termen van voorspelde efficiëntie en specificiteit (Figuur 2). Als er geen gRNA’s worden opgehaald, controleer dan de aanwezigheid van het canonieke Cas9 protospacer aangrenzende motief (PAM) (5′-NGG-3′) in de doelsequentie. Als er geen PAM-sequenties aanwezig zijn, overweeg dan om over te stappen op ETR’s op basis van alternatieve PAM-onafhankelijke Cas9-varianten (er zijn nog geen ETR’s gepubliceerd met deze varianten) of om over te schakelen op alternatieve DNA-bindende domeinplatforms, zoals ZFP’s53 of TALE’s30. Als er echter alleen gRNA’s met een lage voorspelde werkzaamheid/specificiteit worden opgehaald, overweeg dan om 1) deze gRNA’s van lage kwaliteit te testen of 2) de doel-DNA-sequentie uit te breiden, op zoek naar betere gRNA’s. Voer bij voorbijgaande toediening van de drievoudige ETR-combinatie (of CRISPRoff; v2.1) samen met gRNA’s longitudinale flowcytometrieanalyses uit voor de expressie van de fluorescerende reporter, waarbij vaak een piek in de repressie van de verslaggever wordt waargenomen bij acute analyses, die vervolgens op zijn minst gedeeltelijk wordt geresorbeerd als gevolg van mitotische verdunning van de ETR-coderende plasmiden in de loop van de tijd (Figuur 4C). Als de ETR’s/gRNA-combinatie effectief CpG-methylatie afzet op de doellocus, zal permanente onderdrukking van de melder optreden in een aanzienlijk deel van de behandelde cellen (Figuur 4C). Verschillende gRNA’s kunnen een variabele uitschakelingsefficiëntie op lange termijn vertonen (Figuur 4B,C). Gebruik voor genoombrede specificiteitsbeoordelingen MeDIP-seq om de differentieel gemethyleerde regio’s te identificeren tussen cellen waarin het doelwit langdurig tot zwijgen is gebracht en onbehandelde cellen. Idealiter induceert een zeer specifiek gRNA alleen een piek van de novo CpG-methylering op de doellocatie (Figuur 5). Als dat niet het geval is, kan men overwegen om de off-target activiteit van de gRNA’s die op een lagere positie in de on-target efficiëntielijst staan, te karakteriseren. Figuur 1: Integratie van een tdTomato reporter onder de regulerende elementen van het menselijke B2M gen door homologie-gerichte reparatie. Boven: Schema’s van de strategie om een tdTomato fluorescerende reporter te integreren in het eerste intron van het menselijke B2M-gen door CRISPR/Cas9-geïnduceerde homologie-gerichte reparatie. Onder: representatieve dot plots van K-562 cellen voor en na de integratie van de tdTomato reporter in het eerste intron van het B2M gen. Afkortingen: HA = homologie arm; HDR = homologie-gerichte reparatie; IRES = inwendige ribosoomingangsplaats; pa = BGH poly(A); SA = splice acceptor site; WT = wildtype; 3XSTOP = drie in tandem stopcodons. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: In silico identificatie van gRNA’s gericht op het CpG-eiland van het B2M-gen , gerangschikt op voorspelde efficiëntie en specificiteit. De outputinterface van Chchopop toont gRNA’s die zich richten op het CpG-eiland dat is ingebed in de promotorsequentie van het B2M-gen , gerangschikt voor zowel het aantal off-target sequenties met 0 (MM0), 1 (MM1), 2 (MM2) of 3 (MM3) mismatches als de voorspelde on-target efficiëntie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Klonen en arrayed nucleofectie van gRNA’s voor dCas9 ETR-gemedieerde epigenetische uitschakeling. Boven: oligo-gemedieerde protospacer klonering in een humaan U6-gRNA dat plasmide tot expressie brengt. Onder: gearceerde screening van B2M-gerichte gRNA’s voor CRISPR/dCas9-gebaseerde epigenetische uitschakeling door plasmide-nucleofectie in K-562B2M/tdTomato-cellen . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Screening op gRNA’s die effectief langdurige uitschakeling van het B2M-gen induceren. (A) Boven: schema’s van het B2MtdTomato-gen afgebeeld in het vergrote gebied, de relatieve volgorde en oriëntatie van binding van dCas9-gebaseerde ETR’s gecomplexeerd met gRNA’s. Onder: representatieve dot plots van B2MtdTomato K-562 cellen voor (links) of na (rechts) ETR silencing. Analyses 30 dagen na transfectie met plasmiden die coderen voor de gRNA’s en de drievoudige dCas9:KRAB+ dCas9:D3A + dCas9:D3L-combinatie. (B) Uitschakelingsactiviteit van de aangegeven gRNA’s (in pools of als individuele gRNA’s) gericht op het CpG-eiland B2M (rode pijlen in het bovenste schema geven de oriëntatie van de gRNA’s aan) in K-562 B2M tdTomato-cellen op dag 30 na transfectie. Gegevens tonen het percentage tdTomato-negatieve cellen (gemiddelde ± SEM; n = vier onafhankelijke transfecties voor elke behandelingsaandoening). (C) Tijdsverloopanalyse van B2MtdTomato K-562-cellen na transfectie met plasmiden die de drievoudige ETR-combinatie tot expressie brengen en de aangegeven B2M CpG-eilandgerichte gRNA’s of mock (gRNA- en ETR-vrije transfectie). Gegevens tonen het percentage tdTomato-negatieve cellen (gemiddelde ± SEM; n = drie onafhankelijke transfecties voor elke behandelingsaandoening). Niet-gepubliceerde gegevens. Panelen A en B aangepast van Amabile et al.30. Afkortingen: CGI = CpG island; IRES = inwendige ribosoomingangsplaats; pa = BGH poly(A); SA = splice acceptor site; SD = splice donorplaats; TSS = transcriptie startplaats; UT = niet-getransfecteerd; 3XSTOP = 3 in-tandem stop codons. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Genoombrede analyse van de ETR-specificiteit door RNA-seq en door MeDIP-seq. Links: vergelijking van expressieniveaus in nagebootste B2MtdTomato K-562-cellen en cellen die zijn behandeld met de drievoudige dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR-combinatie en met een gRNA dat zich richt op het CpG-eiland van het B2M-gen. De waarden worden uitgedrukt in log2 van reads per kilobase per million (RPKM) van de in kaart gebrachte reads. Zwarte stippen vertegenwoordigen genen die onder alle omstandigheden op vergelijkbare niveaus tot expressie worden gebracht; gele cirkels vertegenwoordigen genen die differentieel worden gereguleerd onder een FDR <0,01; rode cirkel vertegenwoordigt het B2M-IRES-tdTomato-transcript. Rechtsboven: circos-plot met MeDIP-seq-profielen van het hele genoom van gesimuleerde B2MtdTomato K-562-cellen (blauw) of cellen die zijn behandeld met de drievoudige dCas9:KRAB, dCas9:DNMT3A, dCas9:DNMT3L ETR-combinatie en met een gRNA dat zich richt op het CpG-eiland (CGI) van het B2M-gen (groen). Rechtsonder: de methylatiestatus van de B2MtdTomato-locus in de aangegeven monsters wordt weergegeven. In elke pileup zijn drie replicaten vertegenwoordigd; De opeenstapeling van uitgelijnde lezingen werd gladgestreken met behulp van een Gaussiaans venster. Dit cijfer is overgenomen van Amabile et al.30. Afkorting: TSS = transcriptie startplaats. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Gerichte epigenetische uitschakeling kan een veelbelovende oplossing zijn voor de behandeling van aandoeningen die baat kunnen hebben bij permanente geninactivering, waaronder ziekten veroorzaakt door gain-of-function-mutaties1, infectieziekten2 en pathologieën waarbij uitschakeling van het ene gen een erfelijk defectin een ander gen kan compenseren 3 of het volledige potentieel van adoptieve celtherapieën kan ontketenen4, 5. okt. Door te werken op het niveau van chromatine en automatisch te worden voortgeplant door de cel 7,30,32, kan epigenetische uitschakeling toxische veranderingen (bijv. chromosomale herschikkingen) van de DNA-sequentie van het doelgen en gedeeltelijke, voorbijgaande uitschakeling van het doelwit voorkomen, die beperkingen zijn van respectievelijk kunstmatige nuclease-gebaseerde genverstoring 8,34,35 en RNAi-gebaseerde knockdown 33.

Een van de belangrijkste voorbereidende stappen in elk epigenetisch uitschakelprotocol is het identificeren van de juiste positie op het doelgen om de ETR’s aan te sturen die de repressieve epigenetische markeringen zullen deponeren die nodig zijn om de transcriptionele activiteit van het doelwit uit te schakelen. Verschillende transcriptionele startplaats-proximale en -distale regulerende elementen kunnen samenvallen om de transcriptionele output van een bepaald menselijk gen te ondersteunen54. Bovendien kunnen nu verschillende doellocaties per specifiek regulerend element worden geïdentificeerd dankzij het groeiende aantal programmeerbare DNA-bindingstechnologieën6. Daarom kunnen protocollen, zoals het protocol dat hier wordt beschreven in gemanipuleerde cellijnen, worden gebruikt om individuele doellocaties en/of genomische regio’s te nomineren die vatbaar zijn voor ETR-gemedieerde epigenetische uitschakeling, voordat wordt begonnen met omslachtige en tijdrovende evaluatie-inspanningen van de beste kandidaten in de uiteindelijke therapeutische setting. Enkele kritieke aspecten van het protocol worden hieronder verder beschreven.

Engineering van een reportercellijn voorspellend voor het uiteindelijke therapeutische doelwit
Ondanks de constante optimalisatie van celengineeringprotocollen – hier vereist om de cassettecodering voor de fluorescerende reporter in het doelgen te plaatsen en de ETR’s af te leveren – kan het niet als vanzelfsprekend worden beschouwd dat ze al beschikbaar zijn voor de cellijn die het meest lijkt op het uiteindelijke therapeutische doelwit. In dit geval kunnen verschillende mitigatiestrategieën worden toegepast: a) profiteren van optimalisatiekits die door leveranciers worden geleverd om intern het transfectieprotocol voor de doelcellijn te optimaliseren; b) overschakelen naar andere cellijnen die nog steeds dat doelgen tot expressie brengen, maar behoren tot andere weefsels dan het uiteindelijke therapeutische doelwit – waarvoor technische protocollen uitgebreid zijn geoptimaliseerd. Als deze opties niet beschikbaar zijn, kan men overwegen om over te schakelen op primaire celtypen of organoïden die het uiteindelijke doelwit vertegenwoordigen. Als algemene overweging voor zowel preklinische studies als therapeutische toepassingen van ETR-gebaseerde epigenetische uitschakeling, moeten scenario’s waarin het doelgen essentieel is voor het doelceltype worden weggegooid. De volledige, langdurige uitschakeling van een essentieel gen opgelegd door de ETR’s zal in de loop van de tijd leiden tot tegenselectie van de doelcellen (en mogelijk toxiciteit van de behandeling). Alternatieve technologieën die gedeeltelijke doelwitopheffing bieden, zoalsRNAi 33, hebben in deze gevallen de voorkeur.

Evaluatie van de on-target silencing-activiteit van de ETR’s
ETR’s op basis van de combinatie van KRAB-, DNMT3A- en DNMT3L-effectordomeinen hebben bewezen effectief te zijn tegen de grote meerderheid van eiwitcoderende genen, met een breed rond 1 kilobase long-permissief targetingvenster gecentreerd op de transcriptiestartplaats32. Om een idee te krijgen van hoe een goed uitgevoerd epigenetisch uitschakelexperiment eruit ziet, worden hier de technische details en resultaten van het uitschakelen van het B2M-gen in K-562-cellen gegeven. Dit kan worden beschouwd als een belangrijke positieve controle die niet alleen moet worden opgenomen door onderzoekers die met K-562-cellen werken, maar ook door degenen die voor het eerst de op ETR gebaseerde technologie benaderen. Zoals vermeld in het protocol, wordt op kunstmatige nuclease (bijv. CRISPR/Cas9) gebaseerde genverstoring aanbevolen als een extra controle van zowel de efficiëntie van genafgifte in het celtype van belang als van het fenotype van cellen die het doelgen missen. Na de eerste screening van gRNA’s die moeten worden gekoppeld aan de op CRISPR/dCas9 gebaseerde ETR’s, als geen van de geteste gRNA’s in staat is om het doelgen permanent het zwijgen op te leggen, moet worden overwogen, in de volgende volgorde: 1) het verhogen van de hoeveelheid geleverde gRNA’s en ETR’s; 2) het testen van pools van de beste gRNA’s op zoek naar synergetische effecten tussen hen. Als uitschakeling op lange termijn nog steeds niet is bereikt, moet worden overwogen: 3) het testen van extra gRNA’s, die zich kunnen richten op plaatsen die relevanter zijn voor het instrueren van epigenetische uitschakeling; 4) overschakelen naar op ZFP8 of TALE9 gebaseerde DBD-platforms, die mogelijk een verbeterde bindingscapaciteit hebben aan het doelchromatine; 5) overschakelen van voorbijgaand naar stabiel, bijvoorbeeld door de integratie van virale vector-gebaseerde expressie van de ETR’s (ofwel het gRNA of de dCas9-fusieconstructen of beide bij het toepassen van de CRISPR/dCas9-technologie). Aangezien onze groep de gezamenlijke levering van de drie afzonderlijke ETR’s30 heeft ontwikkeld en er veel ervaring mee heeft, zijn het protocol en de resultaten die hier worden getoond, gebaseerd op deze aanpak. Een vergelijkbare conceptuele workflow kan echter waarschijnlijk worden toegepast voor een alles-in-één op CRISPR gebaseerd systeem32.

Evaluatie van de off-target activiteit van de ETR’s
Meerdere onderzoeken hebben voorlopige in vitro indicaties aangetoond voor de specificiteit van ETR’s op basis van de combinatie van KRAB-, DNMT3A- en DNMT3L-effectordomeinen30,31,32. Als echter van de geteste gRNA’s geen van hen een bevredigend specificiteitsprofiel vertoont in termen van transcriptieregulatie en/of de novo DNA-methylering, kan men twee strategieën volgen die elkaar niet uitsluiten: a) het verkorten van de verblijftijd van de ETR’s in de cel (en bijgevolg hun potentiële off-target activiteit) door ofwel de doses ETR’s te verlagen of alternatieve toedieningssystemen te testen. In vergelijking met plasmiden wordt bijvoorbeeld verwacht dat zowel de afgifte van mRNA als eiwitten de blootstellingstijd van de cellen aan de ETR’s zal verkorten en bijgevolg de waarschijnlijkheid van off-target activiteit55; b) overschakelen naar recentere Cas9-varianten, geoptimaliseerd om de off-target binding van het platform56 te verminderen, of naar alternatieve op ZFP8 of TALE9 gebaseerde DNA-bindingstechnologieën. Het is belangrijk om te bedenken dat, in vergelijking met proefbesmette monsters, de on-target en de off-target activiteit van gen-uitschakeling niet alleen worden beïnvloed door de binding van de DBD aan hun doelsequentie, maar ook door het potentiële vermogen van de epigenetische effectordomeinen om naar andere loci te worden gerekruteerd door hun natuurlijke, endogene cofactoren. Daarom kan het verkorten van de verblijftijd van de ETR’s in de doelcel niet alleen de waarschijnlijkheid van binding van de DBD aan off-target sites verminderen, maar ook de waarschijnlijkheid van de ETR’s om te interageren met endogene cofactoren, met potentiële voordelen in termen van specificiteit en nadelen in termen van on-target activiteit. Ten slotte kunnen, in vergelijking met proefbehandelde monsters, sommige van de transcriptionele en minder waarschijnlijke CpG-methylatieveranderingen gemeten in tot zwijgen gebrachte cellen eenvoudig worden afgeleid door de ontbering van het doelgen. Deze worden niet beschouwd als off-targets van de geluiddempingstechnologie. Om ze te identificeren, moet men ook genverstoring door kunstmatige nuclease opnemen in het experimentele panel 8,9,10. Biologische veranderingen als gevolg van het functionele verlies van het doelgen zullen worden gedeeld tussen epigenetische uitschakeling en deze alternatieve technologie.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen Angelo Amabile, Paola Capasso, Ilaria Caserta, Tania Baccega, Alice Reschigna, Valeria Mollica en Deborah Cipria bedanken voor de gezamenlijke inspanning bij het ontwikkelen van de epigenetische uitschakeltechnologie door de jaren heen; Dejan Lazarevic en Francesca Giannese voor kritische beoordeling van de RNA-seq- en MeDIP-seq-analyses die in het protocol worden beschreven. Dit werk werd ondersteund door subsidies aan A.L. van Telethon Foundation (TIGET-subsidie nr. F1) en het EU Horizon 2020-programma (UPGRADE). Er zijn illustraties gemaakt met BioRender.com.

BIJDRAGE VAN DE AUTEURS
A.M., M.A.C., F.G. en A.C. droegen bij aan het ontwerp van het protocol en het schrijven van het manuscript; S.V., I.M. en D.C. ontwierpen de bioinformatica-secties van het protocol en herzagen het manuscript; A.M. en A.L. ontwierpen het protocol, bedachten en schreven het manuscript met input van alle auteurs.

Materials

4200 TapeStation System Agilent G2991BA DNA quantification
4D-Nucleofector X Unit Lonza Bioscience  AAF-1003X Nucleofection
B2M silencing gRNA #1   Lombardo's lab  GCAATCAGGACAAGGCCCGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #2  Lombardo's lab  GGGGTAGGAGAGACTCACGC Gene silencing
B2M silencing gRNA #3  Lombardo's lab  GAGTCCAGGGCTGGATCTCG Gene silencing
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer BD Biosciences https://www.bdbiosciences.com/en-us/products/instruments/flow-cytometers/research-cell-sorters/bd-facsaria-fusion Fluorescence Activated Cell Sorting
bedtools Bedtools http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/ Processing of genomic intervals
bwa Ih3 https://github.com/lh3/bwa Alignment of MeDIP-seq reads
Chopchop  Valen's lab http://chopchop.cbu.uib.no/ gRNA selection software
Corning RPMI 1640 Medium (Mod.) 1x with L-Glutamine Corning 10-040-CV Cell culture
cqn Bioconductor http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/cqn.html Region-wise normalization by GC-content
CRISPR design suite Zhang's lab https://zlab.bio/resources-2 off-target gRNA binding prediction 
CRISPRoff-v2.1 plasmid Addgene  167981 Gene silencing
CytoFLEX S V4-B4-R3-I2 Flow Cytometer  Beckman Coulter C01161 Flow cytometry
Donor template sequence for tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab 

ctcctcctctgacctgtgtgtgggttttgtttttgtttt
actgtgggcataaattaatttttcagttaagttttgg
aagcttaaataactctccaaaagtcataaagcc
agtaactggttgagcccaaattcaaacccagc
ctgtctgatacttgtcctcttcttagaaaagattac
agtgatgctctcacaaaatcttgccgccttccct
caaacagagagttccaggcaggatgaatctgt
gctctgatccctgaggcatttaatatgttcttatta
ttagaagctcagatgcaaagagctctcttagct
tttaatgttatgaaaaaaatcaggtcttcattaga
ttccccaatccacctcttactagtctgacctcttct
cttcctcccacagggataactagatgactcgag
ggatccgaattcctgcaggcctcgacgagggc
cggcgcgccgcggccgctacgtaaattccgc
cccccccccccctctccctcccccccccctaac
gttactggccgaagccgcttggaataaggccg
gtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgc
cgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacct
ggccctgtcttcttgacgagcattcctagggg
tctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtc
tgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctg
gaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagc
gaccctttgcaggcagcggaaccccccacctg
gcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacg
tgtataagatacacctgcaaaggcggcacaac
cccagtgccacgttgtgagttggatagttgtgga
aagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaac
aaggggctgaaggatgcccagaaggtacccc
attgtatgggatctgatctggggcctcggtgcaca
tgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaaacg
tctaggccccccgaaccacggggacgtggtttt
cctttgaaaaacacgatgataatatggccacaa
ccatggtgagcaagggcgaggaggtcatcaa
agagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcgaggg
cgagggcgagggccgcccctacgagggcac
ccagaccgccaagctgaaggtgaccaaggg
cggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtc
cccccagttcatgtacggctccaaggcgtacg
tgaagcaccccgccgacatccccgattacaag
aagctgtccttccccgagggcttcaagtgggag
cgcgtgatgaacttcgaggacggcggtctggtg
accgtgacccaggactcctccctgcaggacgg
cacgctgatctacaaggtgaagatgcgcggca
ccaacttcccccccgacggccccgtaatgcag
aagaagaccatgggctgggaggcctccaccg
agcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaa
gggcgagatccaccaggccctgaagctgaa
ggacggcggccactacctggtggagttcaag
accatctacatggccaagaagcccgtgcaac
tgcccggctactactacgtggacaccaagctg
gacatcacctcccacaacgaggactacacca
tcgtggaacagtacgagcgctccgagggccg
ccaccacctgttcctggggcatggcaccggca
gcaccggcagcggcagctccggcaccgcctc
ctccgaggacaacaacatggccgtcatcaaa
gagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggaggg
ctccatgaacggccacgagttcgagatcga
gggcgagggcgagggccgcccctacgag
ggcacccagaccgccaagctgaaggtgac
caagggcggccccctgcccttcgcctgggac
atcctgtccccccagttcatgtacggctccaa
ggcgtacgtgaagcaccccgccgacatcccc
gattacaagaagctgtccttccccgagggcttc
aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggac
ggcggtctggtgaccgtgacccaggactcct
ccctgcaggacggcacgctgatctacaaggt
gaagatgcgcggcaccaacttcccccccga
cggccccgtaatgcagaagaagaccatggg
ctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccc
cgcgacggcgtgctgaagggcgagatccac
caggccctgaagctgaaggacggcggcca
ctacctggtggagttcaagaccatctacatggc
caagaagcccgtgcaactgcccggctactact
acgtggacaccaagctggacatcacctccca
caacgaggactacaccatcgtggaacagtac
gagcgctccgagggccgccaccacctgttcct
gtacggcatggacgagctgtacaagtaagcgg
ccgcgtcgacctgtgccttctagttgccagccatc
tgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccct
ggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataa
aatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtagg
tgtcattctattctggggggtggggtggggcag
gacagcaagggggaggattgggaagacaat
agcaggcatgctggggatgcggtgggctctat
ggcttaagtgatggggctagtagcctttccttaa
tgatagggtgtttctagagagatatatctggtca
aggtggcctggtactcctccttctccccacagc
ctcccagacaaggaggagtagctgccttttag
tgatcatgtaccctgaatataagtgtatttaaaag
aattttatacacatatatttagtgtcaatctgtatat
ttagtagcactaacacttctcttcattttcaatga
aaaatatagagtttataatattttcttcccacttc
cccatggatggtctagtcatgcctctcattttgg
aaagtactgtttctgaaacattaggcaatatatt
cccaacctggctagtttacagcaactgca

 Genetic engineering
E220 Focused-ultrasonicator Covaris 500239 DNA sonication
edgeR Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/edgeR.html Differential abundance testing
EnGen Mutation Detection Kit NEB E3321 Gene disruption quantification
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F2442 Cell culture
Flowjo BD Biosciences https://www.flowjo.com/solutions/flowjo Flow cytometry data analysis software
Gel Loading Dye, Purple (6x) NEB B7024S DNA gel loading
Go Taq G2 Hot Start DNA Polymerase Promega M7401 PCR amplification
gRNA sequence for dTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AGGCTACTAGCCCCATCAAG Genetic engineering
hCas9 plasmid Addgene  41815 Genetic engineering
High Sensitivity D1000 Reagents Agilent 5067-5585 DNA quantification
High Sensitivity D1000 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 RNA quantification
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 RNA quantification
IPure kit Diagenode C03010011  Purification of the 5-methylcytosine immunoprecipitation product
K-562 cells ATCC CCL-243 Cell engineering
KAPA Library Quantification Kit Roche KK4824 MeDIP-Seq libraries preparation
MACS2 Taoliu https://github.com/macs3-project/MACS Identification of methyl-enriched regions
MagMeDIP kit Diagenode C02010020  5-methylcytosine immunoprecipitation
NextFlex Methylseq kit 1  Bioo Scientific 5118-01 MeDIP-Seq libraries preparation
NextSeq 500 / NovaSeq 6000 Illumina SY-415-1002 / 20012850 Next Generation Sequencing
NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA Macherey-nagel 740410.50 Midiprep plasmid preparation
One Shot TOP10 Chemically Competent  cells  ThermoFisher C404010 Plasmid transformation
pAC154-dual-dCas9VP160-sgExpression plasmid Addgene  48240 Gene activation
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
pcDNA.CMV.dCas9:KRAB plasmid  Lombardo's lab  available on request (lombardo.angelo@hsr.it) Gene silencing
Penicillin/Streptomycin Sigma-Aldrich P0781 Cell culture
phU6.sgRNA plasmid Addgene  53188 Genetic engineering
PowerPac Basic Power Supply Biorad 1645050 Agarose gel electrophoresis
Primer forward sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  GTATTTGCTGGTTATGTTAG Genetic engineering
Primer reverse sequence to check tdTomato integration in the first intron of the B2M gene  Lombardo's lab  AATGGTTGAGTTGGAC Genetic engineering
QIAamp DNA Mini Kit  Qiagen 51304 DNA extraction
Qubit Thermo Fisher Q33238 DNA quantification
Qubit dsDNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32851 DNA quantification
Qubit RNA HS (high sensitivity) Assay Kit Thermo Fisher Q32852 RNA quantification
Restriction enzymes NEB DNA digestion
RNeasy Mini kit  Qiagen 74106 RNA extraction
Rsubread Bioconductor https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/Rsubread.html Quantification of gene expression
SF Cell Line 4D-Nucleofector X Kit S (32 RCT) Lonza Bioscience  V4XC-2032 Nucleofection
SnapGene Dotmatics https://www.snapgene.com/ Molecular biology design software
STAR Alexander Dobin https://github.com/alexdobin/STAR Alignment of RNA-seq reads
T100 Thermal Cycler Biorad 1861096 PCR amplification
T4 DNA Ligase Promega M1801 DNA ligation
TAE Buffer Fisher scientific BP1332500 Agarose gel electrophoresis
TruSeq Stranded Total RNA kit  Illumina 20020597 RNA-Seq library preparation
UltraPure Agarose ThermoFisher 16500500 Agarose gel 
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cummings, C. J., Zoghbi, H. Y. Fourteen and counting: unraveling trinucleotide repeat diseases. Human Molecular Genetics. 9 (6), 909-916 (2000).
  2. Tebas, P., et al. Gene editing of CCR5 in autologous CD4 T cells of persons infected with HIV. The New England Journal of Medicine. 370 (10), 901-910 (2014).
  3. Frangoul, H., et al. CRISPR-Cas9 gene editing for sickle cell disease and β-thalassemia. The New England Journal of Medicine. 384 (3), 252-260 (2021).
  4. Murty, T., Gene Mackall, C. L. Gene editing to enhance the efficacy of cancer cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3153-3162 (2021).
  5. Lanza, R., Russell, D. W., Nagy, A. Engineering universal cells that evade immune detection. Nature Reviews Immunology. 19 (12), 723-733 (2019).
  6. Matharu, N., Ahituv, N. Modulating gene regulation to treat genetic disorders. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (11), 757-775 (2020).
  7. Sgro, A., Blancafort, P. Epigenome engineering: New technologies for precision medicine. Nucleic Acids Research. 48 (22), 12453-12482 (2020).
  8. Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nature Reviews Genetics. 11 (9), 636-646 (2010).
  9. Joung, J. K., Sander, J. D. TALENs: A widely applicable technology for targeted genome editing. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (1), 49-55 (2013).
  10. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  11. Gilbert, L. A., et al. XCRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442 (2013).
  12. Snowden, A. W., Gregory, P. D., Case, C. C., Pabo, C. O. Gene-specific targeting of H3K9 methylation is sufficient for initiating repression in vivo. Current Biology. 12 (24), 2159-2166 (2002).
  13. Chen, X., et al. Construction and validation of the CRISPR/dCas9-EZH2 system for targeted H3K27Me3 modification. Biochemical and Biophysical Research Communications. 511 (2), 246-252 (2019).
  14. Kwon, D. Y., Zhao, Y. T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nature Communications. 8, 15215 (2017).
  15. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Research. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  16. Ecco, G., Imbeault, M., Trono, D. KRAB zinc finger proteins. Development. 144 (15), 2719-2729 (2017).
  17. Witzgall, R., O’leary, E., Leaf, A., Onaldi, D., Bonventre, J. The Kruppel-associated box-A (KRAB-A) domain of zinc finger proteins mediates transcriptional repression. Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (10), 4514-4518 (1994).
  18. Mannini, R., et al. Structure/function of KRAB repression domains: Structural properties of KRAB modules inferred from hydrodynamic, circular dichroism, and FTIR spectroscopic analyses. Proteins: Structure, Function and Genetics. 62 (3), 604-616 (2006).
  19. Friedman, J. R., et al. KAP-1, a novel corepressor for the highly conserved KRAB repression domain. Genes and Development. 10 (16), 2067-2078 (1996).
  20. Iyengar, S., Farnham, P. J. KAP1 protein: An enigmatic master regulator of the genome. The Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26267-26276 (2011).
  21. Schultz, D. C., Friedman, J. R., Rauscher, F. J. Targeting histone deacetylase complexes via KRAB-zinc finger proteins: The PHD and bromodomains of KAP-1 form a cooperative unit that recruits a novel isoform of the Mi-2α subunit of NuRD. Genes and Development. 15 (4), 428-443 (2001).
  22. Schultz, D. C., Ayyanathan, K., Negorev, D., Maul, G. G., Rauscher, F. J. SETDB1: A novel KAP-1-associated histone H3, lysine 9-specific methyltransferase that contributes to HP1-mediated silencing of euchromatic genes by KRAB zinc-finger proteins. Genes and Development. 16 (8), 919-932 (2002).
  23. Nielsen, A. L., et al. Interaction with members of the heterochromatin protein 1 (HP1) family and histone deacetylation are differentially involved in transcriptional silencing by members of the TIF1 family. The EMBO Journal. 18 (22), 6385-6395 (1999).
  24. Sripathy, S. P., Stevens, J., Schultz, D. C. The KAP1 corepressor functions to coordinate the assembly of de novo HP1-demarcated microenvironments of heterochromatin required for KRAB zinc finger protein-mediated transcriptional repression. Molecular and Cellular Biology. 26 (22), 8623-8638 (2006).
  25. Jurkowska, R. Z., Jurkowski, T. P., Jeltsch, A. Structure and function of mammalian DNA methyltransferases. ChemBioChem. 12 (2), 206-222 (2011).
  26. Jia, D., Jurkowska, R. Z., Zhang, X., Jeltsch, A., Cheng, X. Structure of Dnmt3a bound to Dnmt3L suggests a model for de novo DNA methylation. Nature. 449 (7159), 248-251 (2007).
  27. Tajima, S., Suetake, I., Takeshita, K., Nakagawa, A., Kimura, H. Domain structure of the Dnmt1, Dnmt3a, and Dnmt3b DNA methyltransferases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 945, 63-86 (2016).
  28. Greenberg, M. V. C., Bourc’his, D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).
  29. Ishiyama, S., et al. Structure of the Dnmt1 reader module complexed with a unique two-mono-ubiquitin mark on histone H3 reveals the basis for DNA methylation maintenance. Molecular Cell. 68 (2), 350.e7-360.e7 (2017).
  30. Amabile, A., et al. Inheritable silencing of endogenous genes by hit-and-run targeted epigenetic editing. Cell. 167 (1), 219.e14-232.e14 (2016).
  31. Mlambo, T., et al. Designer epigenome modifiers enable robust and sustained gene silencing in clinically relevant human cells. Nucleic Acids Research. 46 (9), 4456-4468 (2018).
  32. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503.e17-2519.e17 (2021).
  33. Davidson, B. L., McCray, P. B. Current prospects for RNA interference-based therapies. Nature Reviews Genetics. 12 (5), 329-340 (2011).
  34. Haapaniemi, E., Botla, S., Persson, J., Schmierer, B., Taipale, J. CRISPR-Cas9 genome editing induces a p53-mediated DNA damage response. Nature Medicine. 24 (7), 927-930 (2018).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Ciccia, A., Elledge, S. J. The DNA damage response: making it safe to play with knives. Molecular Cell. 40 (2), 179-204 (2010).
  37. Hu, J. H., et al. Evolved Cas9 variants with broad PAM compatibility and high DNA specificity. Nature. 556 (7699), 57-63 (2018).
  38. Uhlén, M., et al. Proteomics. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), (2015).
  39. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  40. Kent, W. J., et al. The Human Genome Browser at UCSC. Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).
  41. Cheng, A. W., et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Research. 23 (10), 1163-1171 (2013).
  42. Kabadi, A. M., Ousterout, D. G., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome engineering from a single lentiviral vector. Nucleic Acids Research. 42 (19), e147 (2014).
  43. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  44. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. The Subread aligner: fast, accurate and scalable read mapping by seed-and-vote. Nucleic Acids Research. 41 (10), e108-e108 (2013).
  45. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. GenomeBiology. 17, 13 (2016).
  46. Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
  47. Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).
  48. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 26 (5), 589-595 (2010).
  49. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), R137 (2008).
  50. Quinlan, A. R. BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis. Current Protocols in Bioinformatics. 47, (2014).
  51. Hansen, K. D., Irizarry, R. A., Wu, Z. Removing technical variability in RNA-seq data using conditional quantile normalization. Biostatistics. 13 (2), 204-216 (2012).
  52. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  53. Zeitler, B., et al. Allele-selective transcriptional repression of mutant HTT for the treatment of Huntington’s disease. Nature Medicine. 25 (7), 1131-1142 (2019).
  54. Andersson, R., Sandelin, A. Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nature Reviews Genetics. 21 (2), 71-87 (2020).
  55. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  56. Han, H. A., Pang, J. K. S., Soh, B. -. S. Mitigating off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated in vivo gene editing. Journal of Molecular Medicine. 98 (5), 615-632 (2020).

Tags

Epigenetic SilencingGene SilencingArtificial NucleasesEngineered Transcriptional RepressorsChromatin CompactionTranscriptional InhibitionGene DisruptionRNA InterferenceB2M GeneCRISPR Cas9Nucleofection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Migliara, A., Cappelluti, M. A., Giannese, F., Valsoni, S., Coglot, A., Merelli, I., Cittaro, D., Lombardo, A. In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing. J. Vis. Exp. (195), e64403, doi:10.3791/64403 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image