2D Hücre Kültürü Modelinde Verteporfin Sitotoksisitesini Arttırmak için Şirket İçi İnşa Edilmiş ve Işık Yayan Diyot Tabanlı Fotodinamik Terapi Cihazı
Summary
Burada, iki boyutlu HeLa hücre kültürü ve verteporfin kullanarak in vitro fotodinamik terapi (PDT) testlerini başarılı bir şekilde gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihazı fotosensitizör olarak tanımladık.
Abstract
Bu yazıda, PhotoACT adı verilen in vitro fotodinamik terapi (PDT) tahlillerini gerçekleştirmek için yeni, basit ve düşük maliyetli bir cihaz açıklanmaktadır. Cihaz, bir dizi geleneksel programlanabilir ışık yayan diyot (LED), bir sıvı kristal ekran (LCD) modülü ve ticari bir mikrodenetleyici kartına bağlı bir ışık sensörü kullanılarak üretilmiştir. Prototipin kutu tabanlı yapısı, orta yoğunluklu suntalarla (MDF’ler) yapıldı. İç bölme aynı anda dört hücre kültürü multiwell mikroplakasını tahsis edebilir.
Kavramın bir kanıtı olarak, iki boyutlu (2D) kültürde fotosensitizör (PS) verteporfinin HeLa hücre hattına karşı sitotoksik etkisini inceledik. HeLa hücreleri 24 saat boyunca artan verteporfin konsantrasyonları ile tedavi edildi. İlaç içeren süpernatant ortam atıldı, yapışkan hücreler fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkandı ve ilaçsız ortam eklendi. Bu çalışmada, verteporfinin hücreler üzerindeki etkisi, ışığa maruz kalmadan veya 255, 255 ve 255 kırmızı-yeşil-mavi (RGB) değerleri (ortalama akıcılık 49.1 ± 0.6 J /cm2) kullanılarak ışığa 1 saat maruz kaldıktan sonra incelenmiştir. 24 saat sonra, hücre canlılığı 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile değerlendirildi.
Deneysel sonuçlar, verteporfin ile muamele edilen hücrelerin cihazdan gelen ışığa maruz kalmasının, reaktif oksijen türlerinin (ROS) aracılık ettiği bir mekanizma aracılığıyla ilacın sitotoksik etkisini arttırdığını göstermiştir. Ek olarak, bu çalışmada açıklanan prototipin kullanımı, sonuçların ticari bir PDT cihazı ile karşılaştırılmasıyla doğrulanmıştır. Bu nedenle, bu LED tabanlı fotodinamik terapi prototipi, PDT’nin in vitro çalışmaları için iyi bir alternatiftir.
Introduction
En ölümcül bulaşıcı olmayan hastalıklar arasında kanser, erken ölümün küresel bir önde gelen nedenini temsil etmektedir. 2020’de yaklaşık 10 milyon ölümden sorumluydu ve dünya çapında altı ölümden birini temsilediyordu 1. Ek olarak, çoklu ilaç direnci (MDR) fenomeni, onaylanmış kemoterapötik protokoller bu klinik durum2 için remisyon aşamalarına ulaşamaaşamadığından muazzam bir halk sağlığı tehdidini temsil etmektedir. Kanser hücreleri çeşitli mekanizmalarla kemoterapiye direnç geliştirebilir; Bununla birlikte, bazı ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının (ATP’ye bağımlı efflux pompalar) aşırı ekspresyonu, bir tümör mikroortamında MDR gelişiminin ana nedeni olarak kabul edilir3. ÇİD’ye ek olarak, nüks ve metastaz gibi diğer kanser komplikasyonları, bu onkolojik zorluğun üstesinden gelmek için terapötik yaklaşımların geliştirilmesi ve iyileştirilmesi için acil talebi güçlendirmektedir.
Işığın küratif kullanımı yüzyıllardır uygulanmaktadır4 ve fotodinamik terapi (PDT) solid tümörler için klinik olarak onaylanmış bir terapötik yaklaşımı temsil etmektedir. PDT, tümör hücrelerinde seçici sitotoksisite uygulamak için reaktif oksijen türleri (ROS) üretmek için bir fotosensitizörün (PS) uygulanmasını ve ardından hafif ışınlamayı birleştirir. Bu terapötik yaklaşım, cerrahi, radyasyon ve kemoterapi dahil olmak üzere geleneksel yöntemlerden üstündür5; bağ dokularında daha düşük sitotoksisite gösteren minimal invaziv bir tekniktir6. Doğrudan tümörde veya mikro ortamında ışık uygulaması ve PS birikimi, hassas hedefleme ve sonuç olarak küçük, istenmeyen sistemik yan etkiler7 ve aynı bölgede tekrarlanan tedavi olasılığını sağlar. Dahası, maliyet diğer yaklaşımlardan daha düşüktür. Umut verici özellikleri nedeniyle PDT, özellikle inoperabl tümörlerde veya adjuvan kanser tedavisi7 durumunda hem tek başına hem de tek başına uygun bir seçenek olarak düşünülebilir ve kemoterapi 8,9 ile ilişkili MDR için bir alternatifi temsil eder.
PDT kullanılarak yüksek objektif yanıt oranı gösteren ilk rapor 1975 yılında fare ve sıçan model10’da tanımlanmıştır. O zamandan beri, PDT kullanılarak, 2D hücre kültürü11,12’de insan tümör hücre hatları ile hem in vivo hem de in vitro pozitif sonuçlar7 ile çalışmalar yapılmıştır. Klinik olarak onaylanmış PS’nin geniş uygulanabilirliği göz önüne alındığında, spesifik birikim yolakları ve absorpsiyon piklerinin dalga boyu aralıklarına bakılmaksızın, genel süreç aşağıdaki gibidir: (i) PS alımı, (ii) tümörde veya mikro ortamında PS konsantrasyonunun zirveye ulaşması, (iii) ışık uygulaması, (iv) PS-ışık etkileşimi, (v) PS uyarılmış durum enerjisinin doku substratına veya çevresindeki oksijen moleküllerine aktarılması, (vi) singlet oksijen veya süperoksit anyonu içeren ROS üretimi, (vii) esasen nekroz veya apoptoz (doğrudan ölüm), otofaji (sitoprotektif mekanizma), doku iskemisi (vasküler hasar), immün modülasyon veya bu mekanizmaların örtüşmesi yoluyla tümör hücresi ölümü7. Bu son aşamada, spesifik bir hücre ölüm yolunun aktivasyonu, hücre özellikleri, deneysel tasarım ve en önemlisi PS hücre içi lokalizasyonu ve PDT ile ilişkili hedeflenen hasar gibi birçok faktöre bağlıdır13.
Verteporfin, yaşa bağlı makula dejenerasyonunu tedavi etmek için Norveç ve Çin’de klinik kullanım için düzenleyici kurumlar tarafından onaylanan ikinci nesil bir PS’dir7. Doz verildikten sonra, bu ön ilacın kısmen mitokondri14’te biriktiği ve hücresel protein tirozin fosforilasyonunu ve DNA fragmantasyonunu indükleyerek tümör hücresi apoptozu 15,16’ya yol açtığı bildirilmiştir. Verteporfin içselleştirmesi için 24 saatlik inkübasyondan sonra, bitişik moleküllere etkili elektromanyetik radyasyon transferi seviyeleri elde etmek için 690 nm dalga boyu kurulumu kullanan bir PDT protokolü önerilir 7,17.
PDT için ışık kaynağı ile ilgili olarak, klasik diyot lazer sistemleri genellikle pahalı, teknik olarak karmaşık, büyük boyutlu ve dolayısıyla taşınabilir olmayan 18,19’dur. LED tabanlı PDT ekipmanlarında da gözlemlenebilen tek dalga boyu profilinin bir sonucu olarak, her fotosensitizör uygulaması için bağımsız ünitelere olan talep, diyot lazer sistemlerinin kullanımını daha da karmaşık ve ekonomik olarak imkansız hale getirmektedir20,21. Bu nedenle, LED makinelerin kullanımı sadece maliyet22 ve bakım sorunlarını çözmek için değil, aynı zamanda yüksek güç çıkışı ve daha az zararlı 23 ve daha geniş aydınlatma kapasitesi 24,25,26,27 sağlamak için en umut verici alternatif olarak kabul edilir.
LED tabanlı ekipmanın PDT deneylerine sunabileceği potansiyel katkıya rağmen28, çoğu ticari seçenek hala taşınabilirlik eksikliği, yüksek maliyet ve karmaşık inşaat projeleri ve işletme29 gibi dezavantajlara sahiptir. Bu çalışmanın temel amacı, in vitro PDT testleri için basit ve güvenilir bir araç sunmaktı. Bu makalede, ucuz, kullanıcı dostu ve taşınabilir olan, şirket içi LED tabanlı bir PDT cihazı olan PhotoACT açıklanmaktadır. Kavramın bir kanıtı olarak, bu cihazın bir 2D hücre kültürü modelinde verteporfinin sitotoksisitesini arttırdığı gösterilmiştir ve bu nedenle PDT deneylerinde bir araştırma aracı olarak kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Son PhotoACT cihazı, ticari olarak temin edilebilen, düşük maliyetli bileşenlerle toplam maliyeti 50 dolardan az olan bileşenlerle inşa etmek için uygundu. Ek avantajlar arasında düşük bakım talepleri, birden fazla kültür plakası türünü ışınlama kapasitesi, tahlil başına dört üniteye kadar aynı anda kullanım, taşınabilirliğe izin veren düşük ağırlık (2 kg) / boyut (44cm3), doğru ve tekrarlanabilir ışınlama (veriler gösterilmemiştir) ve bilgisayarlara veya diğer makin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Arthur Henrique Gomes de Oliveira ve Lucas Julian Cruz Gomes’e çekim sürecine yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu proje Brezilya Araştırma Konseyi (CNPq, hibe numaraları 400953/2016-1-404286/2021-6) ve Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma kısmen Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001 tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what’s past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two – cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- . T. SketchUp Available from: https://www.sketchup.com/ (2022)
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022)
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022)
