2D細胞培養モデルにおけるベルテポルフィン細胞毒性を高めるための自作発光ダイオードベースの光線力学治療装置
Summary
ここでは、2次元HeLa細胞培養と光増感剤としての椎体を使用する in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを成功させるための、新しくてシンプルで低コストのデバイスについて説明します。
Abstract
この論文では、PhotoACTと呼ばれる 、in vitro 光線力学療法(PDT)アッセイを実行するための新しい、シンプルで低コストのデバイスについて説明します。このデバイスは、従来のプログラマブル発光ダイオード(LED)、液晶ディスプレイ(LCD)モジュール、および商用マイクロコントローラボードに接続された光センサのセットを使用して構築されました。プロトタイプのボックスベースの構造は、中密度ファイバーボード(MDF)で作られました。内部コンパートメントには、4つの細胞培養マルチウェルマイクロプレートを同時に配置できます。
概念実証として、HeLa細胞株に対する光増感剤(PS)バーテポルフィンの細胞毒性効果を2次元(2D)培養で研究しました。HeLa細胞を、増加濃度のバーテポルフィンで24時間処理した。薬物含有上清培地を廃棄し、接着細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、薬物非含有培地を加えた。この研究では、細胞に対する椎骨の影響を、光に曝露しない場合、または光に1時間曝露した後、赤緑青(RGB)値255、255、および255(平均フルエンス49.1±0.6 J / cm2)を使用して調べました。24時間後、細胞生存率は、3−(4,5−ジメチル−2−チアゾリル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)アッセイによって評価した。
実験結果は、椎骨で処理された細胞をデバイスからの光に曝露すると、活性酸素種(ROS)によって媒介されるメカニズム を介して 薬物の細胞毒性効果が高まることを示しました。さらに、この作業で説明されているプロトタイプの使用は、結果を市販のPDTデバイスと比較することによって検証されました。したがって、このLEDベースの光線力学療法プロトタイプは、PDTの in vitro 研究のための良い代替手段を表しています。
Introduction
最も致命的な非感染性疾患の中で、癌は早死の世界的な主要な原因を表しています。2020年には1,000万人近くが死亡し、世界の約6人に1人が死亡しました1。さらに、多剤耐性(MDR)現象は、承認された化学療法プロトコルがこの臨床状態の寛解段階に到達できないため、公衆衛生上の大きな脅威を表しています2。癌細胞は、いくつかのメカニズムを通じて化学療法に対する耐性を発達させることができます。しかし、一部のATP結合カセット(ABC)トランスポーター(ATP依存性排出ポンプ)の過剰発現は、腫瘍微小環境内でのMDR発生の主な原因と考えられています3。MDRに加えて、再発や転移などの他の癌合併症は、この腫瘍学的課題を克服するための治療アプローチを開発および改善するという緊急の要求を強化します。
光の治療的利用は何世紀にもわたって実践されており4、光線力学療法(PDT)は、固形腫瘍の臨床的に承認された治療アプローチを表しています。PDTは、光増感剤(PS)の投与とそれに続く光照射を組み合わせて活性酸素種(ROS)を生成し、腫瘍細胞に選択的な細胞毒性を発揮します。この治療アプローチは、手術、放射線療法、化学療法などの従来の方法よりも優れています5。これは、結合組織6においてより低い細胞毒性を示す低侵襲技術である。腫瘍またはその微小環境に直接光を当ててPSを蓄積することで、正確な標的化が保証され、その結果、軽微で望ましくない全身性の副作用7と、同じ部位での繰り返し治療の可能性が保証されます。さらに、コストは他のアプローチよりも低くなります。その有望な特徴により、PDTは、特に手術不能な腫瘍の場合の単一または補助的な癌治療7の両方にとって適切な選択肢と見なすことができ、化学療法に関連するMDRの代替手段となります8,9。
PDTを用いた高い客観的奏効率を示す最初の報告は、マウスおよびラットモデル10において1975年に記載された。それ以来、PDTを用いて研究が行われ、2D細胞培養におけるヒト腫瘍細胞株を用いたin vivoおよびin vitroの両方で陽性の結果7が得られました11,12。臨床的に承認されたPSの幅広い適用性を考慮すると、それらの特定の蓄積経路および吸収ピークの波長範囲にかかわらず、一般的なプロセスは以下の通りである:(i)PS取り込み、(ii)腫瘍またはその微小環境におけるPS濃度のピーク、(iii)光の適用、(iv)PS光相互作用、(v)PS励起状態エネルギーの組織基質または周囲の酸素分子のいずれかへの伝達、 (vi)一重項酸素またはスーパーオキシドアニオンを含むROS産生、(vii)腫瘍細胞死を介した、本質的に、壊死またはアポトーシス(直接死)、オートファジー(細胞保護機構)、組織虚血(血管損傷)、免疫調節、またはこれらの機構の重複7。この最終段階では、特定の細胞死経路の活性化は、細胞特性、実験デザイン、そして最も重要なことに、PS細胞内局在およびPDT関連の標的損傷などの多くの要因に依存する13。
Verteporfinは第2世代のPSであり、加齢黄斑変性症を治療するためにノルウェーと中国で臨床使用するために規制当局によって承認されています7。用量送達後、このプロドラッグはミトコンドリアに部分的に蓄積し14、細胞タンパク質チロシンリン酸化およびDNA断片化を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスをもたらすことが報告された15,16。椎骨のインターナリゼーションのための24時間のインキュベーション後、隣接する分子への電磁放射伝達の有効レベルを達成するために、690nmの波長設定を使用するPDTプロトコルが推奨されます7,17。
PDTの光源に関しては、従来のダイオードレーザーシステムは通常高価で、技術的に複雑で、特大であるため、持ち運びが困難です18,19。LEDベースのPDT機器でも観察できる単一波長プロファイルの結果として、各光増感剤アプリケーションのための独立したユニットの需要は、ダイオードレーザーシステムの利用をさらに複雑にし、経済的に実行不可能にします20,21。したがって、LED機械の利用は、コスト22とメンテナンスの問題を解決するだけでなく、高出力と害の少ない23とより広い照明能力を提供する最も有望な代替手段と考えられています24,25,26,27。
LEDベースの機器がPDT実験28に提供できる潜在的な貢献にもかかわらず、ほとんどの商用オプションには、携帯性の欠如、高コスト、複雑な建設プロジェクトおよび操作29などの欠点が依然としてあります。この研究の主な目的は、 in vitro PDTアッセイのためのシンプルで信頼性の高いツールを提供することでした。本稿では、安価で使いやすく、ポータブルな自社製のLEDベースのPDTデバイスであるPhotoACTについて説明します。概念実証として、このデバイスは、2D細胞培養モデルにおける椎骨ポルフィンの細胞毒性を高めることが示されているため、PDT実験の研究ツールとして使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
最終的なPhotoACTデバイスは、市販の低コストコンポーネントで50ドル未満の総コストで構築するのに便利でした。さらに、メンテナンスの要求が少ないこと、複数種類の培養プレートを照射できること、アッセイごとに最大4ユニットの同時使用、携帯性を可能にする軽量(2kg)/サイズ(44cm3)、正確で再現性のある照射(データ未表示)、コンピュータや他の機械への接続を必要としないユー…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
撮影プロセスを手伝ってくれたアーサー・エンリケ・ゴメス・デ・オリベイラとルーカス・ジュリアン・クルス・ゴメスに感謝します。このプロジェクトは、ブラジル研究評議会(CNPq、助成金番号400953 / 2016-1-404286 / 2021-6)およびFundaçãoAraucária-PPSUS 2020/2021(SUS2020131000003)の支援を受けました。この研究は、Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil(CAPES)-Finance Code 001によっても資金提供を受けた。
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
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