מכשיר טיפול פוטודינמי מבוסס דיודה פולטת אור הבנוי בתוך הבית להגברת ציטוטוקסיות של חוליות במודל תרבית תאים דו-ממדית
Summary
כאן אנו מתארים מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מוצלח של מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT) תוך שימוש בתרבית תאי HeLa דו-ממדית וורטפורפין כפוטוסנסיטייזר.
Abstract
מאמר זה מתאר מכשיר חדשני, פשוט ובעלות נמוכה לביצוע מבחני טיפול פוטודינמי במבחנה (PDT), בשם PhotoACT. ההתקן נבנה באמצעות מערך של דיודות פולטות אור (LED) קונבנציונליות הניתנות לתכנות, מודול תצוגת גביש נוזלי (LCD) וחיישן אור המחובר ללוח מיקרו-בקרים מסחרי. המבנה מבוסס התיבה של אב הטיפוס נעשה עם סיבית בצפיפות בינונית (MDFs). התא הפנימי יכול להקצות בו זמנית ארבעה מיקרו-לוחות מרובי תרביות תאים.
כהוכחת היתכנות, חקרנו את ההשפעה הציטוטוקסית של הפוטוסנסיטייזר (PS) verteporfin כנגד קו תאי HeLa בתרבית דו-ממדית (2D). תאי HeLa טופלו בריכוזים הולכים וגדלים של verteporfin במשך 24 שעות. המדיום העל-טבעי המכיל את התרופה הושלך, התאים הדבקים נשטפו בתמיסת מלח עם אגירת פוספטים (PBS), ונוסף מדיום ללא תרופות. במחקר זה נבדקה ההשפעה של ורטפורפין על תאים ללא חשיפה לאור או לאחר חשיפה של שעה אחת לאור באמצעות ערכי אדום-ירוק-כחול (RGB) של 255, 255 ו-255 (פלואנס ממוצע של 49.1 ± 0.6 J/cm2). לאחר 24 שעות, כדאיות התא הוערכה על ידי בדיקת 3-(4,5-דימתיל-2-תיאזוליל)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד (MTT).
תוצאות הניסוי הראו כי חשיפה של תאים שטופלו עם verteporfin לאור מהמכשיר מגבירה את ההשפעה הציטוטוקסית של התרופה באמצעות מנגנון המתווך על ידי מיני חמצן תגובתי (ROS). בנוסף, השימוש באב הטיפוס המתואר בעבודה זו אומת על ידי השוואת התוצאות עם מכשיר PDT מסחרי. לפיכך, אב טיפוס זה של טיפול פוטודינמי מבוסס LED מייצג אלטרנטיבה טובה למחקרים חוץ גופיים של PDT.
Introduction
בין המחלות הקטלניות ביותר שאינן ניתנות לתקשורת, סרטן מהווה גורם מוביל בעולם למוות בטרם עת. הוא היווה כמעט 10 מיליון מקרי מוות בשנת 2020, המייצגים בערך אחד מכל שישה מקרי מוות ברחבי העולם1. בנוסף, תופעת העמידות למולטי-דרוג (MDR) מהווה איום עצום על בריאות הציבור, שכן פרוטוקולים כימותרפיים מאושרים אינם מצליחים להגיע לשלבי הפוגה עבור מצב קליני זה2. תאים סרטניים יכולים לפתח עמידות לכימותרפיה באמצעות מספר מנגנונים; עם זאת, ביטוי יתר של כמה מובילי קלטות מחייבות ATP (ABC) – משאבות efflux תלויות ATP – נחשב הגורם העיקרי להתפתחות MDR בתוך מיקרו-סביבה של גידול3. בנוסף ל- MDR, סיבוכי סרטן אחרים, כגון הישנות וגרורות, מחזקים את הדרישה הדחופה לפתח ולשפר גישות טיפוליות כדי להתגבר על אתגר אונקולוגי זה.
הניצול המרפא של האור היה נהוג במשך מאותשנים, וטיפול פוטודינמי (PDT) מייצג גישה טיפולית מאושרת קלינית לגידולים מוצקים. PDT משלב מתן של פוטו-סנסיטייזר (PS) ואחריו קרינת אור כדי ליצור מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להפעיל ציטוטוקסיות סלקטיבית בתאי הגידול. גישה טיפולית זו עדיפה על השיטות הקונבנציונליות, הכוללות ניתוח, הקרנות וכימותרפיה5; זוהי טכניקה זעיר פולשנית המציגה ציטוטוקסיות נמוכה יותר ברקמות חיבור6. יישום האור והצטברות PS ישירות בגידול או במיקרו-סביבה שלו מבטיחים מיקוד מדויק, וכתוצאה מכך, תופעות לוואי מערכתיות קלות ובלתי רצויות7 ואפשרות לטיפול חוזר באותו אתר. יתר על כן, העלות נמוכה מזו של גישות אחרות. בשל התכונות המבטיחות שלה, PDT יכול להיחשב אופציה מתאימה עבור שניהם יחיד, במיוחד במקרה של גידולים שאינם ניתנים לניתוח, או טיפול בסרטן אדג’ובנטי7, ומייצג חלופה ל- MDR הקשורה לכימותרפיה 8,9.
הדו”ח הראשון שהראה שיעור תגובה אובייקטיבי גבוה באמצעות PDT תואר בשנת 1975 במודל10 של עכבר וחולדה. מאז, נערכו מחקרים באמצעות PDT עם תוצאות חיוביות7 הן in vivo והן in vitro עם קווי תאים סרטניים אנושיים בתרבית תאים דו-ממדית11,12. בהתחשב בתחולה הרחבה של PS שאושר קלינית, ללא קשר למסלולי ההצטברות הספציפיים שלהם ולטווחי אורכי הגל של פסגות הבליעה, התהליך הכללי הוא כדלקמן: (i) ספיגת PS, (ii) שיא של ריכוז PS בגידול או במיקרו-סביבה שלו, (iii) יישום אור, (iv) אינטראקציה PS-light, (v) העברת אנרגיה במצב התרגשות PS למצע רקמה או למולקולות חמצן הסובבות אותם, (vi) ייצור ROS הכולל חמצן סינגלט או אניון סופראוקסיד, (vii) מוות של תאי גידול באמצעות, למעשה, נמק או אפופטוזיס (מוות ישיר), אוטופגיה (מנגנון ציטופרוטקטיבי), איסכמיה של רקמות (נזק לכלי הדם), אפנון חיסוני, או חפיפה של מנגנונים אלה7. בשלב סופי זה, ההפעלה של מסלול מוות תאי מסוים תלויה בגורמים רבים, כגון מאפייני התא, תכנון ניסוי, והכי חשוב, לוקליזציה תוך-תאית של PS ונזק ממוקד הקשור ל-PDT13.
Verteporfin הוא דור שני של PS, שאושר על ידי סוכנויות רגולטוריות לשימוש קליני בנורווגיה ובסין לטיפול בניוון מקולרי הקשור לגיל7. לאחר מתן המינון, דווח כי פרודרוג זה מצטבר באופן חלקי במיטוכונדריה14 וגורם לזרחון חלבון תאי טירוזין ולפיצול DNA, מה שמוביל לאפופטוזיס של תאי הגידול15,16. לאחר דגירה של 24 שעות להפנמת ורטפורפין, מומלץ פרוטוקול PDT המשתמש במערך אורך גל של 690 ננומטר כדי להשיג רמות יעילות של העברת קרינה אלקטרומגנטית למולקולות סמוכות 7,17.
לגבי מקור האור עבור PDT, מערכות הלייזר הדיודה הקלאסיות הן בדרך כלל יקרות, מסובכות מבחינה טכנית, גדולות מדי, ולכן18,19 שאינן ניתנות להעברה. כתוצאה מפרופיל אורך הגל היחיד שלו, שניתן לצפות בו גם בציוד PDT מבוסס LED, הדרישה ליחידות עצמאיות עבור כל יישום פוטו-סנסיטייזר הופכת את השימוש במערכות לייזר דיודה למורכב עוד יותר ובלתי ישים מבחינה כלכלית20,21. לכן, השימוש במכונות LED נחשב לחלופה המבטיחה ביותר לפתרון לא רק עלויות22 ובעיות תחזוקה, אלא גם לספק תפוקת הספק גבוהה ופחות מזיקה 23 ויכולת תאורה רחבה יותר 24,25,26,27.
למרות התרומה הפוטנציאלית שציוד מבוסס LED יכול להציע לניסויי PDT28, לרוב האפשרויות המסחריות עדיין יש חסרונות כגון היעדר ניידות, עלות גבוהה ופרויקטי בנייה מורכבים ותפעול29. המטרה העיקרית של עבודה זו הייתה להציע כלי פשוט ואמין עבור מבחני PDT במבחנה . מאמר זה מתאר את PhotoACT, התקן PDT מבוסס LED שנבנה בתוך החברה, שהוא זול, ידידותי למשתמש ונייד. כהוכחת היתכנות, מכשיר זה הוכח כמגביר את הציטוטוקסיות של ורטפורפין במודל תרבית תאים דו-ממדית, ולכן יכול לשמש ככלי מחקר בניסויי PDT.
Protocol
Representative Results
Discussion
מכשיר PhotoACT הסופי היה נוח לבנייה עם רכיבים זמינים מסחרית בעלות נמוכה בעלות כוללת של פחות מ-$50. יתרונות נוספים כוללים דרישות תחזוקה נמוכות, יכולת להקרין סוגים רבים של לוחות תרבית, שימוש בו זמנית של עד ארבע יחידות לכל בדיקה, משקל נמוך (2 ק”ג)/גודל (44 ס”מ3) המאפשר ניידות, הקרנה מדויקת וניתנת ל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לארתור אנריקה גומז דה אוליביירה ולוקאס ג’וליאן קרוז גומז על שעזרו בתהליך הצילומים. פרויקט זה נתמך על ידי מועצת המחקר הברזילאית (CNPq, מספרי מענקים 400953/2016-1-404286/2021-6) ו- Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). מחקר זה מומן בחלקו גם על ידי Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES)-Finance Code 001.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what’s past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two – cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- . T. SketchUp Available from: https://www.sketchup.com/ (2022)
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022)
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022)
