جهاز علاج ضوئي ديناميكي مدمج وقائم على الصمام الثنائي الباعث للضوء لتعزيز السمية الخلوية للفيرتيبورفين في نموذج زراعة الخلايا 2D
Summary
هنا ، نصف جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) بنجاح في المختبر باستخدام ثقافة خلايا HeLa ثنائية الأبعاد و verteporfin كحساس للضوء.
Abstract
تصف هذه الورقة جهازا جديدا وبسيطا ومنخفض التكلفة لإجراء فحوصات العلاج الضوئي الديناميكي في المختبر (PDT) ، يسمى PhotoACT. تم بناء الجهاز باستخدام مجموعة من الثنائيات التقليدية الباعثة للضوء القابلة للبرمجة (LEDs) ، ووحدة عرض الكريستال السائل (LCD) ، ومستشعر الضوء المتصل بلوحة متحكم تجارية. تم تصنيع الهيكل القائم على الصندوق للنموذج الأولي باستخدام ألواح ليفية متوسطة الكثافة (MDFs). يمكن للمقصورة الداخلية تخصيص أربع لوحات دقيقة متعددة الآبار في وقت واحد.
كدليل على المفهوم ، درسنا التأثير السام للخلايا للمحسس الضوئي (PS) verteporfin ضد خط خلية HeLa في ثقافة ثنائية الأبعاد (2D). عولجت خلايا هيلا بتركيزات متزايدة من فيرتيبورفين لمدة 24 ساعة. تم التخلص من الوسط الطافي المحتوي على الدواء ، وتم غسل الخلايا الملتصقة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، وأضيف وسط خال من المخدرات. في هذه الدراسة ، تم فحص تأثير verteporfin على الخلايا إما دون التعرض للضوء أو بعد التعرض لمدة 1 ساعة للضوء باستخدام قيم الأحمر والأخضر والأزرق (RGB) من 255 و 255 و 255 (متوسط الطلاقة 49.1 ± 0.6 J / cm2). بعد 24 ساعة ، تم تقييم صلاحية الخلية بواسطة مقايسة 3- (4،5-ثنائي ميثيل -2-ثيازوليل) -2،5-ثنائي فينيل تيترازوليوم بروميد (MTT).
أظهرت النتائج التجريبية أن تعرض الخلايا المعالجة ب verteporfin للضوء من الجهاز يعزز التأثير السام للخلايا للدواء عبر آلية بوساطة أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS). بالإضافة إلى ذلك ، تم التحقق من صحة استخدام النموذج الأولي الموصوف في هذا العمل من خلال مقارنة النتائج بجهاز PDT تجاري. وبالتالي ، فإن هذا النموذج الأولي للعلاج الضوئي الديناميكي القائم على LED يمثل بديلا جيدا للدراسات المختبرية ل PDT.
Introduction
من بين أكثر الأمراض غير السارية فتكا، يمثل السرطان سببا رئيسيا عالميا للوفاة المبكرة. وبلغ عدد الوفيات ما يقرب من 10 ملايين حالة وفاة في عام 2020 ، وهو ما يمثل حوالي واحد من كل ستة وفيات في جميع أنحاء العالم1. بالإضافة إلى ذلك ، تمثل ظاهرة مقاومة الأدوية المتعددة (MDR) تهديدا هائلا للصحة العامة ، حيث تفشل بروتوكولات العلاج الكيميائي المعتمدة في الوصول إلى مراحل مغفرة لهذه الحالة السريرية2. يمكن للخلايا السرطانية تطوير مقاومة للعلاج الكيميائي من خلال عدة آليات. ومع ذلك ، فإن الإفراط في التعبير عن بعض ناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC) – مضخات التدفق المعتمدة على ATP – يعتبر السبب الرئيسي لتطور MDR داخل البيئة المكروية للورم3. بالإضافة إلى MDR ، تعزز مضاعفات السرطان الأخرى ، مثل التكرار والورم الخبيث ، الطلب الملح لتطوير وتحسين الأساليب العلاجية للتغلب على هذا التحدي الأورامي.
تم ممارسة الاستخدام العلاجي للضوء لعدة قرون4 ، ويمثل العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) نهجا علاجيا معتمدا سريريا للأورام الصلبة. يجمع PDT بين إعطاء محسس ضوئي (PS) متبوعا بتشعيع خفيف لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) لممارسة السمية الخلوية الانتقائية في الخلايا السرطانية. هذا النهج العلاجي متفوق على الطرق التقليدية ، بما في ذلك الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي5 ؛ إنها تقنية طفيفة التوغل تظهر سمية خلوية أقل في الأنسجة الضامة6. يضمن تطبيق الضوء وتراكم PS مباشرة في الورم أو بيئته المكروية استهدافا دقيقا ، وبالتالي آثارا جانبية جهازية طفيفة وغير مرغوب فيها7 وإمكانية العلاج المتكرر في نفس الموقع. علاوة على ذلك ، فإن التكلفة أقل من تكلفة الأساليب الأخرى. نظرا لميزاته الواعدة ، يمكن اعتبار PDT خيارا مناسبا لكل من الفردي ، خاصة في حالة الأورام غير القابلة للعمل ، أو علاج السرطان المساعد7 ، ويمثل بديلا ل MDR المتعلق بالعلاج الكيميائي 8,9.
تم وصف التقرير الأول الذي يظهر معدل استجابة موضوعي مرتفع باستخدام PDT في عام 1975 في نموذج الفئران والجرذان10. منذ ذلك الحين ، أجريت دراسات باستخدام PDT مع نتائج إيجابية7 في كل من الجسم الحي وفي المختبر مع خطوط الخلايا السرطانية البشرية في ثقافة الخلايا ثنائية الأبعاد11,12. بالنظر إلى قابلية التطبيق الواسع ل PS المعتمد سريريا ، بغض النظر عن مسارات التراكم المحددة ونطاقات الطول الموجي لقمم الامتصاص ، فإن العملية العامة هي كما يلي: (i) امتصاص PS ، (ii) ذروة تركيز PS في الورم أو بيئته المكروية ، (iii) تطبيق الضوء ، (iv) تفاعل ضوء PS ، (v) نقل طاقة الحالة المثارة PS إلى ركيزة الأنسجة أو جزيئات الأكسجين المحيطة ، (vi) إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية التي تنطوي على الأكسجين المفرد أو أنيون الأكسيد الفائق ، (vii) موت الخلايا السرطانية عن طريق ، بشكل أساسي ، النخر أو موت الخلايا المبرمج (الموت المباشر) ، الالتهام الذاتي (آلية الحماية الخلوية) ، نقص تروية الأنسجة (تلف الأوعية الدموية) ، التعديل المناعي ، أو تداخل هذه الآليات7. في هذه المرحلة النهائية ، يعتمد تنشيط مسار موت خلية معين على العديد من العوامل ، مثل خصائص الخلية ، والتصميم التجريبي ، والأهم من ذلك ، توطين PS داخل الخلايا والضرر المستهدف المرتبط ب PDT13.
Verteporfin هو الجيل الثاني من PS ، معتمد من قبل الوكالات التنظيمية للاستخدام السريري في النرويج والصين لعلاج الضمور البقعي المرتبط بالعمر7. بعد تسليم الجرعة ، تم الإبلاغ عن أن هذا الدواء الأولي يتراكم جزئيا في الميتوكوندريا14 ويحفز فسفرة التيروزين البروتين الخلوي وتجزئة الحمض النووي ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج للخلايا السرطانية15,16. بعد 24 ساعة حضانة لاستيعاب verteporfin ، يوصى باستخدام بروتوكول PDT باستخدام إعداد الطول الموجي 690 نانومتر لتحقيق مستويات فعالة من نقل الإشعاع الكهرومغناطيسي إلى الجزيئات المجاورة 7,17.
فيما يتعلق بمصدر الضوء ل PDT ، عادة ما تكون أنظمة ليزر الصمام الثنائي الكلاسيكية باهظة الثمن ومعقدة تقنيا وكبيرة الحجم وبالتالي غير محمولة18,19. نتيجة لملف تعريف الطول الموجي الفردي ، والذي يمكن ملاحظته أيضا في معدات PDT القائمة على LED ، فإن الطلب على الوحدات المستقلة لكل تطبيق محسس ضوئي يجعل استخدام أنظمة ليزر الصمام الثنائي أكثر تعقيدا وغير مجد اقتصاديا20,21. لذلك ، يعتبر استخدام آلات LED البديل الواعد ليس فقط لحل مشاكل التكاليف22 والصيانة ، ولكن أيضا لتوفير خرج طاقة عالي وأقل ضررا 23 وقدرة إضاءة أوسع24،25،26،27.
على الرغم من المساهمة المحتملة التي يمكن أن تقدمها المعدات المستندة إلى LED لتجارب PDT28 ، لا تزال معظم الخيارات التجارية تمتلك عيوبا مثل نقص قابلية النقل والتكلفة العالية ومشاريع البناء المعقدة والتشغيل29. كان الهدف الرئيسي من هذا العمل هو تقديم أداة بسيطة وموثوقة لفحوصات PDT في المختبر . تصف هذه الورقة PhotoACT ، وهو جهاز PDT قائم على LED مدمج داخليا ، وهو غير مكلف وسهل الاستخدام ومحمول. كدليل على المفهوم ، يظهر هذا الجهاز لتعزيز السمية الخلوية لل verteporfin في نموذج زراعة الخلايا 2D ، وبالتالي ، يمكن استخدامه كأداة بحث في تجارب PDT.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان جهاز PhotoACT النهائي مناسبا للبناء بمكونات منخفضة التكلفة متاحة تجاريا بتكلفة إجمالية تقل عن 50 دولارا. وتشمل المزايا الإضافية انخفاض متطلبات الصيانة، والقدرة على تشعيع أنواع متعددة من ألواح الاستزراع، والاستخدام المتزامن لما يصل إلى أربع وحدات لكل فحص، والوزن المنخفض (2 كجم)/الحجم (44?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر آرثر هنريكي غوميز دي أوليفيرا ولوكاس جوليان كروز غوميز للمساعدة في عملية التصوير. تم دعم هذا المشروع من قبل مجلس البحوث البرازيلي (CNPq ، أرقام المنح 400953 / 2016-1-404286 / 2021-6) و Fundação Araucária-PPSUS 2020/2021 (SUS2020131000003). تم تمويل هذه الدراسة جزئيا أيضا من قبل Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) – قانون المالية 001.
Materials
| 0.5% Trypsin-EDTA (10x) | Gibco | 15400054 | Mammalian cell culture dissociation reagent |
| 3D printer | Flashforge | Finder model | |
| 96-well plates | Non-sterile, polystyrene, and high-binding surface plates with flat bottom wells used for 2D cell culture | ||
| Arduino | |||
| Brightness sensor | TSL2561 model with 0.1-40.000+ lux detection levels and I2C interface | ||
| Buttons | |||
| Buzzer | |||
| Cell culture Flasks | Sterile, polystyrene, rectangular bottom flask with Tissue Culture (TC)-treated surface, canted neck and vent cap (sizes) | ||
| Centrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with 15/50 mL capacity used for cell culture dilution at seeding step of the assay | ||
| CO2 Incubator | |||
| Controller board | ESP32 | ||
| Design Software | Trimble | SketchUp | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 11965092 | DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) is a widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540-500ML | Dimethyl sulfoxide, ≥99.5% (GC), suitable for plant cell culture |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 12657029 | FBS provides the best value by delivering consistency of cell growth over time and passages. |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Gibco | 15750060 | Water-soluble antibiotic drug originally purified from the fungus Micromonospora purpurea. Gentamicin acts by preventing cell culture contamination |
| Hemocytometer | Neubauer patterned chamber used for cell counting at seeding step of the assay | ||
| Inverted Laboratory Microscope | Leica | DM IL LED | |
| Laminar Flow Hood | Cabin designed to protect the working environment from contaminants by maintaining a constant, unidirectional flow of HEPA-filtered air over the work area. Used at several steps of cell cultivation and treatment procedures | ||
| LCD display | |||
| LED RGB WS2812 | 5050 RGB SMD model with a built-in processor. Tape with 30 LEDs, 1 meter length and 9 watts | ||
| MDF fiberboards | 3mm thickness medium-density fiberboards | ||
| Microcentrifuge Tubes | Sterile, polypropylene tubes with safety lid and 1.5/2.0 mL capacity. Convenient tools for manipulating small volumes at treatment step of the assay | ||
| Microplate reader | ThermoFischer | Multiskan FC Microplate Photometer designed to detect a broad wavelength range of absorbance (340-850 nm). The equipment was used to evaluate cell viability after MTT incubation. | |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. Used for cell viability assays |
| Operational System | Real Time Engineers ltd. | FreeRTOS | |
| P10 micripipette | Non-electronic, single-channel, 1-10 μL capacity | ||
| P1000 micropipette | Non-electronic, single-channel, 10-1000 μL capacity | ||
| P200 micropipette | Non-electronic, single-channel, 20-200 μL capacity | ||
| PDT Equipment | LumaCare | Model LC-122 | |
| Phosphate-Buffered Saline pH 7.4 | Gibco | 10010031 | Balanced salt formulation used for washing cells during cultivation and assay procedures |
| Potentiometers | |||
| Tips | Non-sterile, universal fit, 10/200/1000 μL maximum volumes | ||
| Verteporfin | Sigma-Aldrich | SML0534-5MG | Verteporfin, ≥94% (HPLC) |
References
- Ferlay, J., et al. International agency for research on cancer. Global Cancer Observatory: Cancer Today. 23 (7), 323-326 (2018).
- Gottesman, M. M., Fojo, T., Bates, S. E. Multidrug resistance in cancer: role of Atp-dependent transporters. Nature Reviews Cancer. 2 (1), 48-58 (2002).
- Szakacs, G., Paterson, J. K., Ludwig, J. A., Boothe-Genthe, C., Gottesman, G. A. Targeting multidrug resistance in cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 5 (3), 219-234 (2006).
- Ackroyd, R., Kelty, C., Brown, N., Reed, M. The history of photodetection and photodynamic therapy. Photochemistry and Photobiology. 74 (5), 656-669 (2001).
- Hamblin, M. R. Photodynamic therapy for cancer: what’s past is prologue. Photochemistry and Photobiology. 96 (3), 506-516 (2020).
- Barr, H., et al. The contrasting mechanisms of colonic collagen damage between photodynamic therapy and thermal injury. Photochem Photobiol. 46 (5), 795-800 (1987).
- Algorri, J. F., Ochoa, M., Roldán-Varona, P., Rodríguez-Cobo, L., López-Higuera, J. M. Photodynamic therapy: A compendium of latest reviews. Cancers. 13 (17), 4447 (2021).
- Aniogo, E. C., Plackal, B., George, B. P. A., Abrahamse, H. The role of photodynamic therapy on multidrug resistant breast cancer. Cancer Cell International. 19, 91 (2019).
- Spring, B. Q., Rizvi, I., Xu, N., Hasan, T. The role of photodynamic therapy in overcoming cancer drug resistance. Photochemical & Photobiological Sciences. 14 (8), 1476-1491 (2015).
- Dougherty, T. J., Grindey, G. B., Fiel, R., Weishaupt, K. R., Boyle, D. G. Photoradiation therapy. II. Cure of animal tumors with hematoporphyrin and light. Journal of the National Cancer Institute. 55 (1), 115-121 (1975).
- Etcheverry, M. E., Pasquale, M. A., Garavaglia, M. Photodynamic therapy of HeLa cell cultures by using LED or laser sources. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 160, 271-277 (2016).
- Guo, Q., Dong, B., Nan, F., Guan, D., Zhang, Y. 5-Aminolevulinic acid photodynamic therapy in human cervical cancer via the activation of microRNA-143 and suppression of the Bcl-2/Bax signaling pathway. Molecular Medicine Reports. 14 (1), 544-550 (2016).
- Mroz, P., Yaroslavsky, A., Kharkwal, G. B., Hamblin, M. R. Cell death pathways in photodynamic therapy of cancer. Cancers. 3 (2), 2516-2539 (2011).
- Mahalingam, S. M., Ordaz, J. D., Low, P. S. Targeting of a photosensitizer to the mitochondrion enhances the potency of photodynamic therapy. ACS Omega. 3 (6), 6066-6074 (2018).
- Granville, D. J., Levy, J. G., Hunt, D. W. C. Photodynamic treatment with benzoporphyrin derivative monoacid ring A produces protein tyrosine phosphorylation events and DNA fragmentation in murine P815 cells. Photochemistry and Photobiology. 67 (3), 358-362 (1998).
- Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: part two – cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodynamic Therapy. 2 (1), 1-23 (2014).
- Detty, M. R., Gibson, S. L., Wagner, S. J. Current clinical and preclinical photosensitizers for use in photodynamic therapy. Journal of Medicinal Chemistry. 47 (16), 3897-3915 (2004).
- Allison, R. R. Photodynamic therapy: oncologic horizons. Future Oncology. 10 (1), 123-142 (2014).
- Chepurna, O., et al. Photodynamic therapy with laser scanning mode of tumor irradiation. Optical Fibers and Their Applications 2015. 9816, 323-326 (2015).
- Huang, Z. A review of progress in clinical photodynamic therapy. Technology in Cancer Research and Treatment. 4 (3), 283-293 (2005).
- Chepurna, O., et al. LED-based portable light source for photodynamic therapy. Optics in Health Care and Biomedical Optics. 11190, 109-115 (2019).
- Hasson, O., Wishkerman, A. CultureLED: A 3D printer-based LED illumination cultivation system for multi-well culture plates. HardwareX. 12, 00323 (2022).
- Wu, X., et al. Localised light delivery on melanoma cells using optical microneedles. Biomedical Optics Express. 13 (2), 1045-1060 (2022).
- Erkiert-Polguj, A., Halbina, A., Polak-Pacholczyk, I., Rotsztejn, H. Light-emitting diodes in photodynamic therapy in non-melanoma skin cancers-own observations and literature review. Journal of Cosmetic and Laser Therapy. 18 (2), 105-110 (2016).
- Neupane, J., Ghimire, S., Shakya, S., Chaudhary, L., Shrivastava, V. P. Effect of light emitting diodes in the photodynamic therapy of rheumatoid arthritis. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 7 (1), 44-49 (2010).
- Lins, E. C., et al. A novel 785-nm laser diode-based system for standardization of cell culture irradiation. Photomedicine and Laser Surgery. 31 (10), 466-473 (2013).
- Hopkins, S. L., et al. An In vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochemical and Photobiological Sciences. 15 (5), 644-653 (2016).
- Zhang, K., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An automated and stable LED array illumination system for multiwell plate cell culture photodynamic therapy experiments. Research Square. , 1-18 (2022).
- Gálvez, E. N., et al. Analysis and evaluation of the operational characteristics of a new photodynamic therapy device. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 37, 102719 (2022).
- Bretin, L., et al. Photodynamic therapy activity of new human colorectal cancer. Cancers. 11 (10), 1474 (2019).
- . T. SketchUp Available from: https://www.sketchup.com/ (2022)
- LCDR PhotoDynamic Therapy (PDT) Equipment Repository. GitHub, Inc Available from: https://github.com/PhotoDynamicTherapy (2022)
- W3C CSS Color Module Level 3. W3C, Inc Available from: https://www.w3.org/TR/css-color-3/#SRGB (2022)
