Bepaling van in vitro en cellulaire inschakelkinetiek voor fluorogene RNA-aptameren
Summary
Het protocol presenteert twee methoden om de kinetiek van de fluorogene RNA-aptameren Spinazie2 en Broccoli te bepalen. De eerste methode beschrijft hoe fluorogene aptamerkinetiek in vitro kan worden gemeten met een platenlezer, terwijl de tweede methode de meting van fluorogene aptamerkinetiek in cellen door flowcytometrie beschrijft.
Abstract
Fluorogene RNA-aptameren zijn toegepast in levende cellen om RNA’s te taggen en te visualiseren, te rapporteren over genexpressie en fluorescerende biosensoren te activeren die niveaus van metabolieten en signaalmoleculen detecteren. Om dynamische veranderingen in elk van deze systemen te bestuderen, is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro en cellulaire turn-on kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met respectievelijk een monsterinjector en een flowcytometer. We tonen aan dat de in vitro kinetiek voor de fluorescentieactivering van de Spinazie2- en Broccoli-aptameren kan worden gemodelleerd als tweefasige associatiereacties en verschillende snelle fasesnelheidsconstanten heeft van respectievelijk 0,56 s−1 en 0,35 s−1. Bovendien tonen we aan dat de cellulaire kinetiek voor de fluorescentieactivering van Spinazie2 in Escherichia coli, die verder wordt beperkt door kleurstofdiffusie in de Gram-negatieve bacteriën, nog steeds voldoende snel is om een nauwkeurige bemonsteringsfrequentie op de minuuttijdschaal mogelijk te maken. Deze methoden om fluorescentieactiveringskinetiek te analyseren zijn van toepassing op andere fluorogene RNA-aptameren die zijn ontwikkeld.
Introduction
Fluorogene reacties zijn chemische reacties die een fluorescentiesignaal genereren. Fluorogene RNA-aptameren vervullen deze functie meestal door een kleine molecuulkleurstof te binden om de fluorescentie-kwantumopbrengst te verbeteren (figuur 1A)1. Verschillende fluorogene RNA aptamer systemen zijn ontwikkeld en bestaan uit specifieke RNA aptamer sequenties en de bijbehorende kleurstof liganden1. Fluorogene RNA-aptameren zijn toegevoegd aan RNA-transcripten als fluorescerende tags die live cell imaging van mRNA’s en niet-coderende RNA’smogelijk maken 2,3,4. Ze zijn ook geplaatst na promotorsequenties als fluorescerende melders van genexpressie, vergelijkbaar met het gebruik van groen fluorescerend eiwit (GFP) als verslaggever, behalve dat de rapportagefunctie zich op het RNA-niveau 5,6 bevindt. Ten slotte zijn fluorogene RNA-aptameren opgenomen in op RNA gebaseerde fluorescerende biosensoren, die zijn ontworpen om de fluorogene reactie te activeren als reactie op een specifiek klein molecuul. RNA-gebaseerde fluorescerende biosensoren zijn ontwikkeld voor live cell imaging van verschillende niet-fluorescerende metabolieten en signaalmoleculen 7,8,9,10,11.
Er is een groeiende belangstelling voor de ontwikkeling van fluorogene RNA-aptameren om dynamische veranderingen in RNA-lokalisatie, genexpressie en kleine molecuulsignalen te visualiseren. Voor elk van deze toepassingen is het wenselijk om real-time metingen te verkrijgen, maar de nauwkeurigheid van de metingen hangt af van het feit of de kinetiek van de fluorogene reactie sneller is dan de bemonsteringsfrequentie. Hier beschrijven we methoden om de in vitro kinetiek voor fluorogene RNA-aptameren Spinazie212 en Broccoli13 te bepalen met behulp van een platenlezer uitgerust met een monsterinjector en om de cellulaire turn-on kinetiek voor Spinazie2 uitgedrukt in Escherichia coli te bepalen met behulp van een flowcytometer. Deze twee RNA-aptameren werden gekozen omdat ze zijn toegepast om RNA-lokalisatie te bestuderen 2,3,4, ze zijn gebruikt in reporters 5,6 en biosensoren 7,8,9,10,11, en de overeenkomstige kleurstofliganden (DFHBI of DFHBI-1T) zijn in de handel verkrijgbaar. Een samenvatting van hun in vitro eigenschappen bepaald in de literatuur is opgenomen in tabel 1 4,13,14, die ten grondslag lag aan de ontwikkeling van het protocol (bv. de gebruikte golflengten en kleurstofconcentraties). Deze resultaten tonen aan dat de fluorogene reacties die worden beïnvloed door RNA-aptameren snel zijn en nauwkeurige metingen voor de gewenste celbiologische toepassingen niet mogen belemmeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor het in vitro kinetische experiment kan hetzelfde algemene protocol worden gewijzigd om de in vitro kinetiek te meten van een op RNA gebaseerde fluorescerende biosensor die zowel een ligandbindend als fluorofoorbindend domein bevat8. In dit geval moet het RNA worden geïncubeerd met de fluorofoor voorafgaand aan metingen bij het injecteren van het ligand om ligandresponskinetiek te verkrijgen. Als er een hoge variabiliteit wordt waargenomen tussen de replicaties, kan men prob…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de volgende subsidies aan MCH: NSF-BSF 1815508 en NIH R01 GM124589. MRM werd gedeeltelijk ondersteund door opleidingsbeurs NIH T32 GM122740.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
