קביעת קינטיקה במבחנה והפעלה תאית עבור אפטאמרים של RNA פלואורוגניים
Summary
הפרוטוקול מציג שתי שיטות לקביעת הקינטיקה של הרנ”א הפלואורוגני אפטאמרים תרד2 וברוקולי. השיטה הראשונה מתארת כיצד למדוד קינטיקה פלואורוגנית של אפטמר במבחנה באמצעות קורא צלחת, ואילו השיטה השנייה מפרטת את מדידת הקינטיקה הפלואורוגנית של אפטמר בתאים על ידי ציטומטריה של זרימה.
Abstract
אפטאמרים פלואורוגניים של RNA יושמו בתאים חיים כדי לתייג ולהמחיש רנ”א, לדווח על ביטוי גנים ולהפעיל ביוסנסורים פלואורסצנטיים המזהים רמות של מטבוליטים ומולקולות איתות. על מנת לחקור את השינויים הדינמיים בכל אחת מהמערכות הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך דיוק המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית שתהיה מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה החוץ-גופית והתאית עבור אפטאמרים פלואורוגניים של RNA באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה וציטומטר זרימה, בהתאמה. אנו מראים כי ניתן למדל את הקינטיקה במבחנה עבור הפעלת הפלואורסצנציה של האפטמרים תרד2 וברוקולי כתגובות אסוציאציה דו-פאזיות ויש להם קבועי קצב פאזה מהירים שונים של 0.56 s−1 ו- 0.35 s−1, בהתאמה. בנוסף, אנו מראים כי הקינטיקה התאית להפעלת פלואורסצנטיות של תרד2 ב-Escherichia coli, המוגבלת עוד יותר על ידי דיפוזיית צבע לחיידקים גראם-שליליים, עדיין מהירה מספיק כדי לאפשר תדירות דגימה מדויקת על ציר הזמן הדק. שיטות אלה לניתוח קינטיקה של הפעלת פלואורסצנציה ישימות לאפטמרים פלואורוגניים אחרים של RNA שפותחו.
Introduction
תגובות פלואורוגניות הן תגובות כימיות היוצרות אות פלואורסצנטי. אפטאמרים פלואורוגניים של RNA בדרך כלל מבצעים את הפונקציה הזו על-ידי קשירת צבע מולקולה קטנה כדי לשפר את התפוקה הקוונטית הפלואורסצנטית שלה (איור 1A)1. פותחו מערכות אפטמר RNA פלואורוגניות שונות המורכבות מרצפי RNA אפטמר ספציפיים ומליגנדות הצבעהמתאימות 1. אפטאמרים של RNA פלואורוגניים צורפו לתעתיקי RNA כתגי פלואורסצנט המאפשרים הדמיה של תאים חיים של mRNA ו-RNAsשאינם מקודדים 2,3,4. הם גם הוצבו לאחר רצפי מקדמים כמדווחים פלואורסצנטיים של ביטוי גנים, בדומה לשימוש בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כמדווח, אלא שפונקציית הדיווח היא ברמת RNA 5,6. לבסוף, אפטאמרים של RNA פלואורוגניים שולבו בביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA, שנועדו לעורר את התגובה הפלואורוגנית בתגובה למולקולה קטנה ספציפית. ביוסנסורים פלואורסצנטיים מבוססי RNA פותחו להדמיית תאים חיים של מטבוליטים שונים שאינם פלואורסצנטיים ומולקולות איתות 7,8,9,10,11.
יש עניין גובר בפיתוח אפטמרים של RNA פלואורוגניים כדי לדמיין שינויים דינמיים בלוקליזציה של RNA, ביטוי גנים ואותות של מולקולות קטנות. עבור כל אחד מהיישומים הללו, רצוי לקבל מדידות בזמן אמת, אך הדיוק של המדידות תלוי בקינטיקה של התגובה הפלואורוגנית להיות מהירה יותר מתדר הדגימה. במאמר זה נתאר שיטות לקביעת הקינטיקה במבחנה עבור רנ”א פלואורוגני אפטאמרים תרד2 12 וברוקולי13 באמצעות קורא צלחות המצויד במזרק דגימה ולקביעת הקינטיקה הדלקתית התאית עבורתרד2 המתבטאת ב-Escherichia coli באמצעות ציטומטר זרימה. שני אפטאמרים אלה של RNA נבחרו מכיוון שהם יושמו כדי לחקור לוקליזציה של RNA 2,3,4, הם שימשו בכתבים 5,6 וביוסנסורים 7,8,9,10,11, וליגנדות הצבע המתאימות (DFHBI או DFHBI-1T) זמינות מסחרית. סיכום של תכונותיהם במבחנה שנקבעו בספרות מובא בטבלה 1 4,13,14, אשר ביססה את התפתחות הפרוטוקול (למשל, אורכי הגל וריכוזי הצבעים שבהם נעשה שימוש). תוצאות אלה מראות כי התגובות הפלואורוגניות המושפעות מאפטאמרים של RNA הן מהירות ואינן אמורות לעכב מדידות מדויקות עבור היישומים הביולוגיים הרצויים של התא.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבור ניסוי הקינטיקה במבחנה, ניתן לשנות את אותו פרוטוקול כללי כדי למדוד את הקינטיקה במבחנה של ביוסנסור פלואורסצנטי מבוסס RNA המכיל גם תחום קושר ליגנד וגם תחום קושר פלואורופור 8. במקרה זה, יש לדגור את הרנ”א עם הפלואורופור לפני המדידות בעת הזרקת הליגנד על מנת לקבל קינטיק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים ל- MCH: NSF-BSF 1815508 ו- NIH R01 GM124589. MRM נתמך חלקית על ידי מענק הכשרה NIH T32 GM122740.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
