Florojenik RNA Aptamers için In Vitro ve Hücresel Turn-on Kinetiğinin Belirlenmesi
Summary
Protokol, florojenik RNA aptamers Ispanak2 ve Brokolinin kinetiğini belirlemek için iki yöntem sunar. İlk yöntem, florojenik aptamer kinetiğinin in vitro olarak bir plaka okuyucu ile nasıl ölçüleceğini açıklarken, ikinci yöntem hücrelerdeki florojenik aptamer kinetiğinin akış sitometrisi ile ölçülmesini detaylandırır.
Abstract
Florojenik RNA aptamerleri, RNA’ları etiketlemek ve görselleştirmek, gen ekspresyonu hakkında rapor vermek ve metabolitlerin ve sinyal moleküllerinin seviyelerini tespit eden floresan biyosensörleri aktive etmek için canlı hücrelere uygulanmıştır. Bu sistemlerin her birindeki dinamik değişiklikleri incelemek için, gerçek zamanlı ölçümlerin elde edilmesi arzu edilir, ancak ölçümlerin doğruluğu, florojenik reaksiyonun kinetiğinin örnekleme frekansından daha hızlı olmasına bağlıdır. Burada, sırasıyla bir numune enjektörü ve bir akış sitometresi ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak florojenik RNA aptamers için in vitro ve hücresel açma kinetiğini belirleme yöntemlerini açıklıyoruz. Ispanak2 ve Brokoli aptamerlerinin floresan aktivasyonu için in vitro kinetiğin iki fazlı ilişki reaksiyonları olarak modellenebileceğini ve sırasıyla 0.56 s-1 ve 0.35 s-1’lik farklı hızlı faz hızı sabitlerine sahip olduğunu gösteriyoruz. Ek olarak, Escherichia coli’deki Ispanak2’nin floresan aktivasyonu için hücresel kinetiğin, Gram-negatif bakterilere boya difüzyonu ile daha da sınırlı olduğunu, dakika zaman ölçeğinde doğru örnekleme sıklığını sağlamak için hala yeterince hızlı olduğunu gösteriyoruz. Floresan aktivasyon kinetiğini analiz etmek için kullanılan bu yöntemler, geliştirilen diğer florojenik RNA aptamerlerine uygulanabilir.
Introduction
Florojenik reaksiyonlar, floresan sinyali üreten kimyasal reaksiyonlardır. Florojenik RNA aptamerler tipik olarak floresan kuantum verimini arttırmak için küçük bir molekül boyasını bağlayarak bu işlevi yerine getirir (Şekil 1A)1. Farklı florojenik RNA aptamer sistemleri geliştirilmiştir ve spesifik RNA aptamer dizilerinden ve buna karşılık gelen boya ligandlarından oluşur1. Florojenik RNA aptamerleri, mRNA’ların ve kodlamayan RNA’ların canlı hücre görüntülemesini sağlayan floresan etiketler olarak RNA transkriptlerine eklenmiştir 2,3,4. Ayrıca, raporlama fonksiyonu RNA seviyesi5,6 olması dışında, yeşil floresan proteininin (GFP) muhabir olarak kullanılmasına benzer şekilde, gen ekspresyonunun floresan raporlayıcıları olarak promotör dizilerinden sonra yerleştirilmişlerdir. Son olarak, florojenik RNA aptamerleri, belirli bir küçük moleküle yanıt olarak florojenik reaksiyonu tetiklemek için tasarlanmış RNA bazlı floresan biyosensörlere dahil edilmiştir. RNA bazlı floresan biyosensörler, çeşitli floresan olmayan metabolitlerin ve sinyal molekülleri 7,8,9,10,11’in canlı hücre görüntülemesi için geliştirilmiştir.
RNA lokalizasyonu, gen ekspresyonu ve küçük molekül sinyallerindeki dinamik değişiklikleri görselleştirmek için florojenik RNA aptamerlerinin geliştirilmesine artan ilgi vardır. Bu uygulamaların her biri için, gerçek zamanlı ölçümlerin elde edilmesi arzu edilir, ancak ölçümlerin doğruluğu, florojenik reaksiyonun kinetiğinin örnekleme frekansından daha hızlı olmasına bağlıdır. Burada, florojenik RNA aptamers Ispanak2 12 ve Brokoli13 için in vitro kinetiği bir örnek enjektör ile donatılmış bir plaka okuyucu kullanarak belirlemek ve bir akış sitometresi kullanarak Escherichia coli’de eksprese edilen Ispanak2 için hücresel açılma kinetiğini belirlemek için yöntemler açıklanmaktadır. Bu iki RNA aptamer seçildi çünkü RNA lokalizasyonu 2,3,4’ü incelemek için uygulandılar, muhabirler 5,6 ve biyosensörler 7,8,9,10,11’de kullanıldılar ve karşılık gelen boya ligandları (DFHBI veya DFHBI-1T) ticari olarak temin edilebilir. Literatürde belirlenen in vitro özelliklerinin bir özeti, protokol gelişimini (örneğin, kullanılan dalga boyları ve boya konsantrasyonları) bildiren Tablo 1 4,13,14’te verilmiştir. Bu sonuçlar, RNA aptamerlerinden etkilenen florojenik reaksiyonların hızlı olduğunu ve istenen hücre biyolojik uygulamaları için doğru ölçümleri engellememesi gerektiğini göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vitro kinetik deneyi için, aynı genel protokol, hem ligand bağlayıcı hem de florofor bağlayıcı alan8 içeren RNA tabanlı bir floresan biyosensörün in vitro kinetiğini ölçmek için değiştirilebilir. Bu durumda, RNA, ligand yanıt kinetiği elde etmek için ligand enjekte edildikten sonra ölçümlerden önce florofor ile inkübe edilmelidir. Replikalar arasında yüksek değişkenlik gözlenirse, her numunenin ölçümden önce 96 delikli plakada aynı süre bo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma MCH’YE aşağıdaki hibelerle desteklenmiştir: NSF-BSF 1815508 ve NIH R01 GM124589. MRM, eğitim hibesi NIH T32 GM122740 tarafından kısmen desteklenmiştir.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
