蛍光発生RNAアプタマーの in vitro および細胞ターンオン動態の決定

蛍光発生反応は、蛍光シグナルを生成する化学反応です。蛍光発生RNAアプタマーは通常、低分子色素を結合させて蛍光量子収率を高めることでこの機能を果たします(図1A)¹。異なる蛍光発生RNAアプタマーシステムが開発されており、特定のRNAアプタマー配列および対応する色素リガンドからなる¹。蛍光発生RNAアプタマーは、mRNAおよびノンコーディングRNAの生細胞イメージングを可能にする蛍光タグとしてRNA転写物に付加されています^2,3,4。それらはまた、レポーターとしての緑色蛍光タンパク質(GFP)の使用と同様に、遺伝子発現の蛍光レポーターとしてプロモーター配列の後に配置されていますが、報告機能はRNAレベル^5,6です。最後に、蛍光発生RNAアプタマーは、特定の低分子に応答して蛍光発生反応を引き起こすように設計されたRNAベースの蛍光バイオセンサーに組み込まれています。RNAベースの蛍光バイオセンサーは、様々な非蛍光代謝物およびシグナル伝達分子の生細胞イメージングのために開発されている⁷、^8、9、^10、11。

RNAの局在、遺伝子発現、および低分子シグナルの動的な変化を可視化するための蛍光発生RNAアプタマーの開発への関心が高まっています。これらの各アプリケーションでは、リアルタイムの測定値を取得することが望ましいですが、測定の精度は、蛍光発生反応の速度論がサンプリング周波数よりも速いことに依存します。ここでは、試料注入器を備えたプレートリーダーを用いて蛍光発生RNAアプタマーSmallach2 12およびBroccoli¹³のin vitro動態を決定する方法と、フローサイトメーターを使用して大腸菌で発現するSpinach2の細胞ターンオン動態を決定する方法について説明します。これら2つのRNAアプタマーが選ばれたのは、RNA局在^2,3,4の研究に適用されており、レ^{ポーター5,6}およびバイオセンサー7,8,9,10,11で使用されており、対応する色素リガンド(DFHBIまたはDFHBI-1T)が市販されているためです。文献で決定されたそれらのインビトロ特性の要約は^、表1⁴、¹³、¹⁴に与えられ、これはプロトコール開発(例えば^、使用される波長および色素濃度)を知らせた。これらの結果は、RNAアプタマーの影響を受ける蛍光発生反応が迅速であり、目的の細胞生物学的用途の正確な測定を妨げるべきではないことを示しています。