تحديد حركية التشغيل في المختبر والخلوية لأبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري
Summary
يقدم البروتوكول طريقتين لتحديد حركية أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري السبانخ2 والبروكلي. تصف الطريقة الأولى كيفية قياس حركية الأبتامير الفلورية في المختبر باستخدام قارئ الألواح ، بينما توضح الطريقة الثانية قياس حركية الأبتامير الفلورية في الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي.
Abstract
تم تطبيق أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري في الخلايا الحية لوضع علامة على الحمض النووي الريبي وتصوره ، والإبلاغ عن التعبير الجيني ، وتنشيط المستشعرات الحيوية الفلورية التي تكتشف مستويات المستقلبات وجزيئات الإشارة. من أجل دراسة التغيرات الديناميكية في كل من هذه الأنظمة ، من المستحسن الحصول على قياسات في الوقت الفعلي ، لكن دقة القياسات تعتمد على حركية التفاعل الفلوري أسرع من تردد أخذ العينات. هنا ، نصف طرق تحديد حركية التشغيل في المختبر والخلوية لأبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري باستخدام قارئ لوحة مجهز بحاقن عينة ومقياس تدفق خلوي ، على التوالي. لقد أظهرنا أن الحركية في المختبر لتنشيط التألق ل Spinach2 و Broccoli aptamers يمكن نمذجتها على أنها تفاعلات ارتباط ثنائية الطور ولها ثوابت معدل طور سريع مختلفة تبلغ 0.56 s−1 و 0.35 s−1 ، على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، نظهر أن الحركية الخلوية لتنشيط التألق للسبانخ2 في الإشريكية القولونية ، والتي يتم تقييدها بشكل أكبر بسبب انتشار الصبغة في البكتيريا سالبة الجرام ، لا تزال سريعة بما يكفي لتمكين تردد أخذ العينات بدقة على مقياس زمني دقيق. تنطبق هذه الطرق لتحليل حركية تنشيط التألق على أبتامات الحمض النووي الريبي الفلورية الأخرى التي تم تطويرها.
Introduction
التفاعلات الفلورية هي تفاعلات كيميائية تولد إشارة مضان. عادة ما تؤدي أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري هذه الوظيفة عن طريق ربط صبغة جزيء صغيرة لتعزيز عائدها الكمي الفلوري (الشكل 1 أ)1. تم تطوير أنظمة أبتامير RNA مختلفة الفلوروجين وتتكون من تسلسلات محددة من الحمض النووي الريبي أبتامير وروابط الصبغة المقابلة1. تم إلحاق أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري بنسخ الحمض النووي الريبي كعلامات فلورية تمكن من تصوير الخلايا الحية ل mRNAs و RNAs غير المشفرة2،3،4. كما تم وضعها بعد تسلسل المروج كمراسلين فلورسنت للتعبير الجيني ، على غرار استخدام بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) كمراسل ، باستثناء وظيفة الإبلاغ عند مستوى الحمض النووي الريبي 5,6. أخيرا ، تم دمج أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري في أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية القائمة على الحمض النووي الريبي ، والتي تم تصميمها لتحفيز التفاعل الفلوري استجابة لجزيء صغير معين. تم تطوير أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية القائمة على الحمض النووي الريبي لتصوير الخلايا الحية لمختلف المستقلبات غير الفلورية وجزيئات الإشارة7،8،9،10،11.
هناك اهتمام متزايد بتطوير أبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري لتصور التغيرات الديناميكية في توطين الحمض النووي الريبي ، والتعبير الجيني ، وإشارات الجزيئات الصغيرة. لكل من هذه التطبيقات ، من المستحسن الحصول على قياسات في الوقت الفعلي ، لكن دقة القياسات تعتمد على حركية التفاعل الفلوري أسرع من تردد أخذ العينات. هنا ، نصف طرق تحديد حركية المختبر لأبتامير الحمض النووي الريبي الفلوري السبانخ212 والبروكلي13 باستخدام قارئ لوحة مجهز بحاقن عينة ولتحديد حركية التشغيل الخلوي للسبانخ2 المعبر عنها في الإشريكية القولونية باستخدام مقياس التدفق الخلوي. تم اختيار هذين الأبتامير RNA لأنه تم تطبيقهما لدراسة توطين الحمض النووي الريبي2،3،4 ، وقد تم استخدامهما في المراسلين5،6 وأجهزة الاستشعار الحيوية7،8،9،10،11 ، وروابط الصبغة المقابلة (DFHBI أو DFHBI-1T) متاحة تجاريا. ويرد ملخص لخصائصها في المختبر المحددة في الأدبيات في الجدول 14،13،14 ، والذي أبلغ تطوير البروتوكول (على سبيل المثال ، الأطوال الموجية وتركيزات الصبغة المستخدمة). توضح هذه النتائج أن التفاعلات الفلورية المتأثرة بأبتامير الحمض النووي الريبي سريعة ويجب ألا تعيق القياسات الدقيقة للتطبيقات البيولوجية الخلوية المطلوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
بالنسبة لتجربة الحركية في المختبر ، يمكن تعديل نفس البروتوكول العام لقياس الحركية في المختبر لجهاز استشعار حيوي فلوري قائم على الحمض النووي الريبي يحتوي على كل من مجال ربط الليجند وربط الفلوروفور8. في هذه الحالة ، يجب تحضين الحمض النووي الريبي مع الفلوروفور قبل الق?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال المنح التالية لصحة الأم والطفل: NSF-BSF 1815508 و NIH R01 GM124589. تم دعم MRM جزئيا من خلال منحة التدريب NIH T32 GM122740.
Materials
| Agarose | Thermo Fischer Scientific | BP160500 | |
| Agarose gel electrophoresis equipment | Thermo Fischer Scientific | B1A-BP | |
| Alpha D-(+)-lactose monohydrate | Thermo Fischer Scientific | 18-600-440 | |
| Amber 1.5 mL microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | 22431021 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| Attune NxT Flow cytometer | Thermo Fischer Scientific | A24861 | |
| Attune 1x Focusing Fluid | Thermo Fischer Scientific | A24904 | |
| Attune Shutdown Solution | Thermo Fischer Scientific | A24975 | |
| Attune Performance Tracking Beads | Thermo Fischer Scientific | 4449754 | |
| Attune Wash Solution | Thermo Fischer Scientific | J24974 | |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
| Carbenicillin disodium salt | Sigma-Aldrich | C3416 | |
| Chlorine Bleach | Amazon | B07J6FJR8D | |
| Corning Costar 96-well plate | Daigger Scientific | EF86610A | |
| Culture Tubes, 12 mm x 75 mm, 5 mL with attached dual position cap | Globe Scientific | 05-402-31 | |
| DFHBI | Sigma-Aldrich | SML1627 | |
| DFHBI-1T | Sigma-Aldrich | SML2697 | |
| D-Glucose (anhydrous) | Acros Organics | AC410955000 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
| DNA loading dye | New England Biolabs | B7025S | |
| DNA LoBind Tubes (2.0 mL) | Eppendorf | 22431048 | |
| dNTPs: dATP, dCTP, dGTP, dTTP | New England Biolabs | N0446S | |
| EDTA, pH 8.0 | Gibco, Life Technologies | AM9260G | |
| Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Filter-tip micropipettor tips | Thermo Fischer Scientific | AM12635, AM12648, AM12655, AM12665 | |
| FlowJo Software | BD Biosciences | N/A | FlowJo v10 Software |
| Fluorescent plate reader with heating control | VWR | 10014-924 | |
| Gel electrophoresis power supply | Thermo Fischer Scientific | EC3000XL2 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Glycogen AM95010 | Thermo Fischer Scientific | AM95010 | |
| GraphPad Prism | Dotmatics | N/A | Analysis software from Academic Group License |
| Heat block | Thomas Scientific | 1159Z11 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Inorganic pyrophosphatase | Sigma-Aldrich | I1643-500UN | |
| Low Molecular Weight DNA Ladder | New England Biolabs | N3233L | Supplied with free vial of Gel Loading Dye, Purple (6x), no SDS (NEB #B7025). |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Fisher Scientific | MFCD00011110 | |
| Microcentrifuge tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22363204 | |
| Microcentrifuge with temperature control | Marshall Scientific | EP-5415R | |
| Micropipettors | Gilson | FA10001M, FA10003M, FA10005M, FA10006M | |
| Micropipettor tips | Sigma-Aldrich | Z369004, AXYT200CR, AXYT1000CR | |
| Millipore water filter with BioPak unit | Sigma-Aldrich | CDUFBI001, ZRQSVR3WW | |
| Narrow micropipettor pipette tips | DOT Scientific | RN005R-LRS | |
| PBS, 10x | Thermo Fischer Scientific | BP39920 | |
| PCR clean-up kit | Qiagen | 28181 | |
| PCR primers and templates | Integrated DNA technologies | ||
| PCR thermocycler for thin-walled PCR tubes | Bio-Rad | 1851148 | |
| PCR thermocycler for 0.5 mL tubes | Techne | 5PRIME/C | |
| pET31b-T7-Spinach2 Plasmid | Addgene | Plasmid #79783 | |
| Phusion High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs | M0530L | Purchase of Phusion High-Fideldity Enzyme is supplied with 5x Phusion HF Buffer, 5x Phusion GC Buffer, and MgCl2 and DMSO solutions. |
| Polyacrylamide gel electrophoresis gel comb, C.B.S. Scientific | C.B.S. Scientific | VGC-1508 | |
| Polyacrylamide gel electrophoresis equipment | C.B.S. Scientific | ASG-250 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Razor blades | Genesee Scientific | 38-101 | |
| rNTPs: ATP, CTP, GTP, UTP | New England Biolabs | N0450L | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Short wave UV light source | Thermo Fischer Scientific | 11758221 | |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Thermo Fischer Scientific | S375-500 | |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | N/A | SoftMax Pro 6.5.1 (platereader software) obtained through Academic Group License |
| Sterile filter units | Thermo Fischer Scientific | 09-741-88 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SYBR Safe DNA gel stain | Thermo Fischer Scientific | S33102 | |
| TAE buffer for agarose gel electrophoresis | Thermo Fischer Scientific | AM9869 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | TRIS-RO | |
| Tryptone (granulated) | Thermo Fischer Scientific | M0251S | |
| T7 RNA polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Urea-PAGE Gel system | National Diagnostics | EC-833 | |
| UV fluorescent TLC plate | Sigma-Aldrich | 1.05789.0001 | |
| UV/Vis spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | ND-8000-GL | |
| Vortex mixer | Thermo Fischer Scientific | 2215415 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| Yeast Extract (Granulated) | Thermo Fischer Scientific | BP9727-2 |
References
- Su, Y., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of small molecules and RNAs. Current Opinion in Biotechnology. 63, 157-166 (2020).
- Zhang, J., et al. Tandem spinach array for mRNA Imaging in living bacterial cells. Scientific Reports. 5, 17295 (2015).
- Wang, Z., et al. In spatial complementation of aptamer-mediated recognition enables live-cell imaging of native RNA transcripts in real time. Angewandte Chemie. 57 (4), 972-976 (2018).
- Strack, R. L., Disney, M. D., Jaffrey, S. R. A superfolding Spinach2 reveals the dynamic nature of trinucleotide repeat-containing RNA. Nature Methods. 10 (12), 1219-1224 (2013).
- Thavarajah, W., et al. Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor. ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).
- You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (21), 2756-2765 (2015).
- Kellenberger, C. A., Wilson, S. C., Sales-Lee, J., Hammond, M. C. RNA-based fluorescent biosensors for live cell imaging of second messengers cyclic di-GMP and cyclic AMP-GMP. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 4906-4909 (2013).
- Manna, S., Truong, J., Hammond, M. C. Guanidine biosensors enable comparison of cellular turn-on kinetics of riboswitch-based biosensor and reporter. ACS Synthetic Biology. 10 (3), 566-578 (2021).
- Bose, D., Su, Y., Marcus, A., Raulet, D. H., Hammond, M. C. An RNA-based fluorescent biosensor for high-throughput analysis of the cGAS-cGAMP-STING pathway. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1539-1549 (2016).
- Wang, X. C., Wilson, S. C., Hammond, M. C. Next-generation RNA-based fluorescent biosensors enable anaerobic detection of cyclic di-GMP. Nucleic Acids Research. 44 (17), 139 (2016).
- Paige, J. S., Thinh, N. -. D., Wenjiao, S., Jaffrey, S. R. Fluorescence imaging of cellular metabolites with RNA. Science. 335 (6073), 1194 (2012).
- Paige, J. S., Wu, K. Y., Jaffrey, S. R. RNA mimics of green fluorescent protein. Science. 333 (6042), 642-646 (2011).
- Filonov, G. S., Moon, J. D., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Broccoli: Rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution. Journal of the American Chemical Society. 136 (46), 16299-16308 (2014).
- Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of spinach. Journal of the American Chemical Society. 136 (4), 1198-1201 (2014).
- Sambrook, J., Fritsch, E., Maniatis, T. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (1989).
- Basch, H., Gadebusch, H. H. In vitro antimicrobial activity of dimethylsulfoxide. Applied Microbiology. 16 (12), 1953-1954 (1968).
- Kallansrud, G., Ward, B. A comparison of measured and calculated single- and double-stranded oligodeoxynucleotide extinction coefficients. Analytical Biochemistry. 236 (1), 134-138 (1996).
- Wilson, S. C., Cohen, D. T., Wang, X. C., Hammond, M. C. A neutral pH thermal hydrolysis method for quantification of structured RNAs. RNA. 20 (7), 1153-1160 (2014).
- Szatmári, D., et al. Intracellular ion concentrations and cation-dependent remodelling of bacterial MreB assemblies. Scientific Reports. 10, 12002 (2020).
- Boulos, L., Prévost, M., Barbeau, B., Coallier, J., Desjardins, R. LIVE/DEAD® BacLightTM: Application of a new rapid staining method for direct enumeration of viable and total bacteria in drinking water. Journal of Microbiological Methods. 37 (1), 77-86 (1999).
- Huang, H., et al. A G-quadruplex-containing RNA activates fluorescence in a GFP-like fluorophore. Nature Chemical Biology. 10 (8), 686-691 (2014).
- Jeng, S. C. Y., Chan, H. H. Y., Booy, E. P., McKenna, S. A., Unrau, P. J. Fluorophore ligand binding and complex stabilization of the RNA Mango and RNA Spinach aptamers. RNA. 22 (12), 1884-1892 (2016).
- Han, K. Y., Leslie, B. J., Fei, J., Zhang, J., Ha, T. Understanding the photophysics of the Spinach-DFHBI RNA aptamer-fluorogen complex to improve live-cell RNA imaging. Journal of the American Chemical Society. 135 (50), 19033-19038 (2013).
- Wang, P., et al. Photochemical properties of Spinach and its use in selective imaging. Chemical Science. 4 (7), 2865-2873 (2013).
- Dao, N. T., et al. Photophysics of DFHBI bound to RNA aptamer Baby Spinach. Scientific Reports. 11, 7356 (2021).
