Verwendung von In-vivo-Bildgebung zum Screening auf Morphogenese-Phänotypen in Candida albicans mutierten Stämmen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt
Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine Methode zum Screening mittelgroßer Candida albicans-Mutantenbibliotheken auf Morphogenesephänotypen während einer aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mittels nicht-invasiver konfokaler Mikroskopie.
Abstract
Candida albicans ist ein wichtiger humanpathogener Erreger. Seine Fähigkeit, zwischen morphologischen Formen zu wechseln, ist von zentraler Bedeutung für seine Pathogenese; Diese morphologischen Veränderungen werden durch ein komplexes Signalnetzwerk reguliert, das als Reaktion auf Umweltreize gesteuert wird. Diese regulatorischen Komponenten wurden intensiv untersucht, aber fast alle Studien verwenden eine Vielzahl von In-vitro-Stimuli, um die Filamentation auszulösen. Um zu bestimmen, wie die Morphogenese während des Pathogeneseprozesses reguliert wird, entwickelten wir ein In-vivo-Mikroskopiesystem, um hochauflösende Bilder von Organismen zu erhalten, die sich im Säugetierwirt hyphalisch bilden. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt die Verwendung dieses Systems zum Screening kleiner Sammlungen von C. albicans-Mutantenstämmen, so dass wir die wichtigsten Regulatoren der Morphogenese identifizieren können, wie sie am Ort der Infektion auftreten. Es werden repräsentative Ergebnisse vorgestellt, die zeigen, dass einige Regulatoren der Morphogenese, wie der Transkriptionsregulator Efg1, konsistente Phänotypen in vitro und in vivo haben, während andere Regulatoren, wie die Adenylzyklase (Cyr1), signifikant unterschiedliche Phänotypen in vivo im Vergleich zu in vitro aufweisen.
Introduction
Candida albicans ist ein häufiger humaner Pilzerreger, der mukokutane Erkrankungen, disseminierte Erkrankungen und lokalisierte Gewebeinfektionen verursacht1. Ein wesentliches Merkmal der Physiologie von C. albicans ist ihr komplexes polymorphes Wachstum, das mit seiner Rolle als Kommensal- und Krankheitserreger verbunden ist 2,3,4. Unter nährstoffreichen Bedingungen in vitro bei 30 °C wächst sie typischerweise als eiförmige Knospungshefe. Eine Vielzahl von Umweltauslösern, einschließlich Nährstoffentzug, pH-Änderungen, Wachstum bei 37 ° C, Exposition gegenüber Serum und Wachstum bei Einbettung in Agar, führen zum Übergang zu einem polarisierten Wachstumsmuster, was zur Bildung echter Hyphen und / oder Pseudohyphen führt5. Die Initiierung des polarisierten Wachstums und das daraus resultierende Wachstum filamentöser Organismen wird als Morphogenese bezeichnet.
Aufgrund der Bedeutung der Morphogenese für die Virulenz des Organismus wurde die Regulation der Hyphenbildung umfassend untersucht 6,7. Es gibt ein komplexes Netzwerk von Signalwegen und transkriptioneller Regulation, das die Morphogenese auslöst. Trotz der Beziehung der Morphogenese von C. albicans mit der Pathogenese haben die meisten Studien, die die Morphogenese untersuchen, In-vitro-Stimuli verwendet, um die Hyphenbildung auszulösen. Es wird immer deutlicher, dass die verschiedenen in vitro Modelle der Filamentation hinsichtlich der einzelnen stimulierten Regulationswege nicht identisch sind. Darüber hinaus korrespondieren keine In-vitro-Wachstumsbedingungen eng mit der komplexen Umgebung des Wirts. Angesichts der Bedeutung von C. albicans als menschlicher Krankheitserreger besteht das Ziel dieses Protokolls darin, seine Morphogenese während der aktiven Infektion in einem Säugetierwirt mit einem System mit moderatem Durchsatz zu untersuchen, so dass ein Forscher C. albicans mutierte Bibliotheken untersuchen kann.
Um diese Untersuchungen zu erleichtern, wurde ein in vivo Bildgebungssystem entwickelt, das es uns ermöglicht, hochauflösende Bilder von C. albicans-Zellen während der Infektion der Ohrmuschel einer anästhesierten Maus mit einem inversen konfokalen Mikroskop8,9,10 zu erhalten. Da die Haut der Ohrmuschel ziemlich dünn ist, können diese Bilder ohne Gewebedissektion erhalten werden. So können quantitative Phänotypdaten am Ort aktiver Infektionen im Wirtsgewebe gemessen werden. Das hier beschriebene Protokoll beinhaltet die Transformation eines Referenzstamms und eines oder mehrerer mutierter Stämme mit unterschiedlichen fluoreszierenden Proteinexpressionskassetten11,12. Die fluoreszierenden proteinexprimierenden Stämme werden dann gemischt und intradermal co-injiziert. Nachdem die Infektion festgestellt wurde, wird die konfokale Bildgebung verwendet, um sowohl die Häufigkeit der Filamentation als auch die Länge der gebildeten Filamente zu quantifizieren. Die von den mutierten Stämmen erhaltenen Daten werden auf die des Referenzstamms normalisiert, der in derselben Geweberegion vorhanden ist, wodurch eine interne Kontrolle gewährleistet ist. Dieses System hat es uns ermöglicht, mehrere Serien von C. albicans-Mutantenstämmen, von denen viele Morphogenesedefekte in vitro9,10 aufweisen, erfolgreich zu screenen. Viele dieser Stämme filamentieren leicht in vivo, was die Bedeutung von In-vivo-Modellen für die Untersuchung der Morphogenese unterstreicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Modell verwendet konfokale Mikroskopie, um Bilder von C. albicans-Organismen zu erhalten, wie sie im Gewebe eines Säugetierwirts wachsen, so dass wir die Morphogenese-Phänotypen während der aktiven Infektion bewerten können. Der Prozess der Morphogenese ist von zentraler Bedeutung für die Pathogenese von C. albicans und wurde mit einer Vielzahl von In-vitro-Assays umfassend untersucht 2,3,4. Kein In-vitro-Assay kann jedoch die komplexe biochemische und strukturelle Umgebung des Wirts vollständig modellieren.
Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf die Verwendung dieses In-vivo-Bildgebungssystems, um eine Reihe / Bibliothek von C. albicans-Mutanten zu screenen, um die Gene zu identifizieren, die an der Morphogenese während der Infektion beteiligt sind. Die Verwendung von C. albicans-Stämmen, die verschiedene fluoreszierende Proteine exprimieren, ermöglicht es uns, die In-vivo-Morphogenese von C. albicans-Mutantenstämmen im Vergleich zu einem Referenzstamm zu quantifizieren. Der Vergleich der Morphogenese in der Mutante mit dem Referenzstamm innerhalb desselben Infektionsgebiets stellt sicher, dass die Organismen identischen Umgebungen ausgesetzt sind. Dies ermöglicht eine quantitative Messung des Prozentsatzes der Zellen, die einer Filamentation unterzogen werden, sowie des Ausmaßes der Filamentation. Die Normalisierung der Messungen des/der mutierten Stammes/e auf die des Referenzstamms ermöglicht es uns, die Leistung einer Mutante besser mit einer anderen zu vergleichen.
Die hier vorgestellten repräsentativen Ergebnisse zeigen das Potenzial für eine signifikante Diskrepanz zwischen in vitro und in vivo Phänotypen. Der C. albicans efg1ΔΔ mutierte Stamm wird häufig als Negativkontrolle für Morphogenese-Assays verwendet, da er unter fast allen In-vitro-Bedingungen nicht filamentieren kann20. Obwohl die In-vivo-Ergebnisse den In-vitro-Ergebnissen sehr ähnlich waren, bildete selbst dieser stark behinderte Stamm gelegentlich Filamente in der Umgebung des Wirtsgewebes (Abbildung 3). Dies unterstreicht die Stärke der Wirtsumgebung bei der Auslösung der Morphogenese.
Im Gegensatz dazu zeigt der cyr1ΔΔ-mutierte Stamm eine erhebliche Diskrepanz zwischen in vitro und in vivo Wachstum; Obwohl keine der mutierten Zellen in vitro einer Filamentation unterzogen wird, wächst etwa die Hälfte der Zellen in vivo als Filamente (Abbildung 4)10,21. Interessanterweise waren diese Filamente signifikant kürzer als diejenigen, die durch den Referenzstamm gebildet wurden, was darauf hindeutet, dass CYR1 entweder zur Wachstumsrate des Filaments oder zur Fähigkeit beiträgt, einen filamentösen Phänotyp aufrechtzuerhalten. Um die Analyse der Filamentlänge zu erleichtern, wurde die Kurvenweglänge der Filamente mit einer zweidimensionalen Projektion der Bilder gemessen. In zweidimensionalen Projektionen von Filamenten, die in drei Dimensionen wachsen, wird jedes Filament, das auf einer Achse wächst, die nicht parallel zur xy-Ebene ist, kürzer als seine wahre Länge projiziert. Da diese Verkürzung auch für den Referenzstamm auftritt, erlaubt die Auswertung der Verteilung der Filamentlängen in einer zweidimensionalen Projektion dennoch einen quantitativen Vergleich zwischen Referenz- und Mutantenstämmen. Die Analyse der Filamentlänge in zwei statt drei Dimensionen erfordert eine weniger intensive Bildanalyse; Somit kann es relativ schnell auf einem typischen Desktop-Computer durchgeführt werden. Die Verwendung dieser einfacheren Analyse ermöglicht die Einbeziehung der Filamentlängenverteilung als Teil eines Screening-Protokolls, was ein nuancierteres Verständnis der Fähigkeit jeder Mutante ermöglicht, eine Morphogenese zu durchlaufen, ohne wesentliche Verzögerungen beim Durchsatz zu verursachen.
Die hier vorgestellten repräsentativen Studien wurden mit DBA2/N-Mäusen durchgeführt, die einen Defekt in ihrem Komplementsystem aufweisen, der dazu führt, dass Neutrophile nicht an den Ort der C. albicans-Infektion rekrutiertwerden 22. Ziel dieser Studien war es, Mechanismen der Regulation der C. albicans-Filamentation im Wirtsgewebe zu untersuchen. Daher wurden DBA2/N-Mäuse verwendet, um zu vermeiden, dass die Ergebnisse aufgrund der Anfälligkeit oder Resistenz eines einzelnen Stammes gegen Neutrophile verfälscht werden. Da die neutrophile Anti-C. albicans-Antwort die Filamentation beeinflussen kann23, könnte die Rekrutierung von Neutrophilen an die Infektionsstelle die Ergebnisse eines Morphogenese-Assays beeinflussen. Wenn ein Stamm in der Lage ist, in vivo zu filamentieren, aber stark von der Filamentation gehemmt wird, wenn Neutrophile vorhanden sind, würde eine Filamentation bei DBA2 / N-Mäusen nachgewiesen, aber es wäre unwahrscheinlich, dass sie bei Mäusen mit intakter neutrophiler Chemotaxis beobachtet wird. Daher ist die Belastung der Maus, die als Host verwendet wird, ein wichtiger Faktor bei der Verwendung dieses Protokolls.
Die Beobachtung, dass der efg1ΔΔ-mutierte Stamm nicht in vivo filamentiert, ist unwahrscheinlich, dass er mit den Neutrophilenantworten des Wirts zusammenhängt, da dieser Stamm auch nicht in vitro filamentiert. Die in vivo beobachtete Filamentation mit dem Cyr1ΔΔ-Stamm ist diskordant mit dem Versagen der Filamentation in vitro. Daten aus dem Zebrafischmodell der C. albicans-Infektion deuten darauf hin, dass ansprechende Neutrophile wichtig für die Prävention der Morphogenese sind24. Daher ist es unwahrscheinlich, dass die Verwendung von DBA2/N-Mäusen, denen neutrophile Antworten fehlen, die Zunahme der Filamentation des Cyr1ΔΔ in vivo im Vergleich zu in vitro erklärt. Nichtsdestotrotz beeinflusst die In-vivo-Umgebung eindeutig die Morphogenese des Cyr1ΔΔ-Stammes; Daher kann die weitere Untersuchung dieses Stammes wichtige Informationen über die Regulation der Morphogenese von C. albicans während aktiver Infektionen liefern. Das hier beschriebene Protokoll ist als Screening-Assay konzipiert, um Stämme wie den cyr1ΔΔ-Stamm zu identifizieren, der in zukünftigen Studien verwendet werden soll.
Die Verwendung eines Low-Flow-Gasanästhesiesystems ist für dieses Protokoll sehr hilfreich (Abbildung 1A,B). Während der anfänglichen Entwicklung dieses Protokolls wurden Mäuse mit einem injizierbaren Anästhesiecocktail aus Ketamin gemischt mit Xylazin betäubt. Während es möglich war, eine begrenzte Bildgebung mit dieser Anästhesiemethode durchzuführen, war die Dauer der Anästhesie unvorhersehbar, so dass die Bildgebungssitzungen schnell beendet werden mussten, um zu vermeiden, dass sich die Maus während der Bildgebung von der Anästhesie erholte. Herkömmliche inhalative Anästhesiesysteme sind sperrig und erfordern hohe Durchflussraten von Anästhesiegasen, die oft in einem Abzug verwendet werden müssen. Daher wären herkömmliche inhalative Anästhesiesysteme mit den Platzbeschränkungen eines konfokalen Mikroskops sehr schwierig zu verwenden, ohne die Forscher versehentlich den Anästhetika auszusetzen. Die Verwendung eines Low-Flow-Inhalationsanästhesiesystems ermöglicht eine konsistente Anästhesie des Tieres bei gleichzeitiger Aufrechterhaltung einer sicheren Umgebung für den Ermittler. Der Low-Flow-Nasenkegel ermöglicht eine einfache Positionierung des Tieres sowohl für die Impfung als auch für die Mikroskopie. Der kleinkalibrige, kleinvolumige Verabreichungsschlauch ermöglicht die Verwendung relativ langer Schläuche, wodurch das Anästhesiegerät in ausreichendem Abstand platziert werden kann, um die Mikroskopie nicht zu stören.
Das in typischen Mäusesuppen vorhandene Chlorophyll führt zu einer signifikanten Gewebeautofluoreszenz25. Dies führt zu erheblichem Rauschen in den Bildern, was es schwierig macht, qualitativ hochwertige Bilder mit hoher räumlicher Auflösung zu erhalten. Wenn die Tiere vor der Bildgebung 7 Tage lang mit chlorophyllfreiem Chow gefüttert wurden, war der Hintergrund der Autofluoreszenz im Gewebe erheblich verringert, aber das im Haar abgelagerte Chlorophyll war weiterhin problematisch. Das Entfernen der Haare auf den Ohrmuscheln mit einer rezeptfreien chemischen Enthaarungscreme minimiert die Autofluoreszenz im Haar wirksam (Abbildung 1C, D). So verringerte die Kombination aus chlorophyllfreiem Chow und ausreichender Haarentfernung die Autofluoreszenz erheblich und verbesserte die Bildqualität dramatisch. Da die Haare vor der Bildgebung aus dem Ohr entfernt werden, hat die Farbe der Haare des Tieres keinen Einfluss auf dieses System. Dieses Protokoll wurde erfolgreich verwendet, um C. albicans-Infektionen bei BALB/c (weiß), C57BL/6 (schwarz) und DBA2/N (braun) Mäusen zu untersuchen. Das Protokoll kann auch mit C57BL/6-Knockout-Mäusen verwendet werden, denen verschiedene Wirtsgene fehlen; Dies wird zukünftige Untersuchungen ermöglichen, wie das Immunsystem des Säugetierwirts die Filamentation beeinflusst. Ein Merkmal dieses Modells, das in diesem Protokoll nicht diskutiert wird, ist, dass dasselbe Tier über mehrere Tage hinweg wiederholt abgebildet werden kann, da dieses Bildgebungssystem nicht-invasiv ist, so dass der Fortschritt der individuellen Infektion im Laufe der Zeit verfolgt werden kann. Dieses Merkmal wird wahrscheinlich eine Schlüsselrolle in zukünftigen Studien zur Wirt-Pathogen-Interaktion spielen.
Zusammenfassend führt dieses Protokoll zu hochauflösenden Bildern von C. albicans, die im Gewebe eines lebenden Säugetierwirts wachsen, was eine genaue Bewertung der Morphogenese in mutierten Stämmenermöglicht 8,9,10. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, wie dieses Protokoll verwendet werden kann, um eine Bibliothek von C. albicans-Mutanten zu screenen. Von den bisher getesteten C. albicans-Mutanten wird ein großer Teil der Mutanten mit bekannten Defekten in der Morphogenese in vitro leicht in vivo filamentiert 9,10. Dies unterstreicht, wie wichtig es ist, ein In-vivo-System wie dieses in Experimente einzubeziehen, die die Mechanismen der Pathogenese von C. albicans aufklären sollen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den NIH-Zuschuss 1R01AI33409 und die Abteilung für Pädiatrie des Carver College of Medicine der University of Iowa unterstützt.
Materials
| #1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
| 0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
| 3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
| 70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
| Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
| C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
| Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
| Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
| Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
| DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
| Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
| Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
| Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
| Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
| ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
| Isoflurane | Akorn | J119005 | |
| Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
| Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
| Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
| Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
| pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
| Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
| RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
| Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |
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