Использование визуализации In Vivo для скрининга фенотипов морфогенеза у мутантных штаммов Candida albicans во время активной инфекции у хозяина млекопитающих

Исследования в этом протоколе были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Университета Айовы (IACUC). Обратитесь к руководству CDC по оборудованию и процедурам работы с организмами BSL213. 1. Приготовление штаммов Candida albicans Определите подходящий эталонный штамм для использования в качестве положительного контроля. Убедитесь, что этот штамм близко соответствует экспериментальным штаммам с точки зрения его родословной и генетических манипуляций.ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных экспериментов, представленных здесь, мутанты были созданы из штаммов, описанных в Homann, et al.14, которые были построены из SN152. Эти мутанты являются Arg-. Поэтому эталонным штаммом был выбран SN250, который также был создан из SN152 и также является Arg-. Пищевые стрессоры имеют решающее значение в регуляции поляризованного роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae15; они также были вовлечены в филаментацию у C. albicans и других грибов 16,17,18. Поэтому эталонный штамм должен быть сопоставлен для ауксотрофий с экспериментальными штаммами, когда это возможно, чтобы избежать потенциальных смешанных эффектов от пищевого стресса. Выбирайте флуоресцентные конструкции экспрессии белка. При скрининге различных экспериментальных штаммов создайте эталонный штамм, который экспрессирует один флуоресцентный белок, и используйте другие флуоресцентные белки для маркировки мутантных штаммов.ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные данные, представленные здесь, используют NEON для эталонного штамма и iRFP для мутантных штаммов. Любой флуоресцентный белок может быть использован, если он высоко экспрессирован, относительно яркий и может возбуждаться / обнаруживаться используемым микроскопом. Контрольные эксперименты, сравнивающие эталонные штаммы, экспрессирующие различные флуоресцентные белки, не продемонстрировали какого-либо влияния экспрессии флуоресцентных белков на морфогенез. Преобразуйте штаммы с помощью флуоресцентных конструкций экспрессии белка.ПРИМЕЧАНИЕ: Многие учреждения требуют использования мер предосторожности уровня биологической безопасности 2 для работы с C. albicans. Все работы должны выполняться в соответствии с местными правилами безопасности. Независимо от местных правил, исследователи, работающие с C. albicans , должны быть обучены безопасному обращению с организмом.Преобразование эталонных и экспериментальных штаммов с использованием стандартных протоколов19 ацетата лития.ПРИМЕЧАНИЕ: В экспериментах, описанных здесь, используются плазмиды pENO1-NEON-NATR и pENO1-iRFP-NATR, щедро предоставленные доктором Робертом Уилером11,12. Плазмиды были линеаризированы с использованием NotI9. Выбирайте трансформанты на основе роста на нурсеотрицине или другой соответствующей селекционной среде. Определите успешные трансформаторы. Выберите небольшой кусочек клеток из каждой колонии с помощью зубочистки, а затем смешайте их с капелькой воды объемом 2,5 мкл на предметном стекле микроскопа. Наложите крышку и осмотрите с увеличением 10x-40x. Исследуйте с помощью конфокальной системы визуализации (используемой для остальной части протокола) или любого стандартного широкопольного флуоресцентного микроскопа. Соответствующие трансформаторы будут иметь яркий сигнал с соответствующими длинами волн возбуждения и излучения.ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных результатов штаммы, экспрессирующие NEON, визуализировали с помощью вертикального флуоресцентного микроскопа с длиннопроходным фильтром с полосовым фильтром возбуждения 472/30 нм, полосовым эмиссионным фильтром 520/35 нм и одноближным дихроичным делителем пучка 495 нм. Поскольку iRFP не виден глазом, экспрессирующие iRFP штаммы были визуализированы с использованием системы конфокальной микроскопии, используемой для визуализации in vivo , с использованием лазера 638 нм для возбуждения и обнаружения излучения света от 655-755 нм.В качестве альтернативы, оцените макроскопическую колониальную флуоресценцию с использованием флуоресцентной стереомикроскопии, ручных флуоресцентных систем возбуждения или систем обнаружения флуоресценции, обычно используемых для гелей и вестерн-блотов. Создание морозильных запасов выбранных трансформаторов. Инокулируйте твердые среды YPD (дрожжевого экстракта пептона декстрозы) флуоресцентным эталоном, экспрессирующим белок, и экспериментальные штаммы из морозильных запасов за 3 дня до инъекции, используя зубочистку для переноса мазка организмов из морозильной камеры в твердую среду YPD. Инкубировать при 30 °C в течение 2 дней. Для каждого штамма прививайте колбу, содержащую 25 мл YPD, клетками C. albicans , взятыми из нескольких колоний за 1 день до инъекции. Сделайте это, используя зубочистку, чтобы перенести мазок организмов из одной колонии в YPD; повторить несколько раз, чтобы получить клетки из нескольких разных колоний. Инкубировать в течение ночи при 30 °C в орбитальном шейкерном инкубаторе при 175 об/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать несколько колоний в качестве источника для инокулята, потому что C. albicans имеет высокую частоту спонтанных генетических изменений. Использование нескольких колоний при запуске культуры инокулята сводит к минимуму вероятность того, что все организмы в инокуляте возникают у родителя со значительными спонтанными изменениями. В день инъекции:Центрифуга 1 мл культуры в течение 2 мин при 500 х г. Промыть культуру три раза 1 мл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора Dulbecco (dPBS). После окончательной промывки повторно суспендировать гранулу в 1 мл стерильного дПБС. Разбавить образец промытой культуры в 1:100 и посчитать с помощью гемоцитометра. Отрегулируйте плотность промытой культуры до 1 х 108 организмов на мл с помощью дПБС. Для каждого набора штаммов, подлежащих введению, создайте инокулятивный метод путем смешивания равных объемов эталонного штамма и экспериментального штамма (штаммов). Это поддерживает плотность инокулята на уровне 1 х 108 организмов на мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество штаммов, которые могут быть оценены на ухо, ограничено способностью системы микроскопии, используемой для четкого различения сигнала от каждого флуоресцентного белка. После того, как инокулятив будет приготовлен, приступайте непосредственно к инъекциям животному. Не храните инокулятор перед использованием. 2. Подготовка животных Получить одобрение от местного Институционального комитета по уходу за животными и их использованию или соответствующего местного руководящего органа. Получите 6-12-недельных мышей от поставщика или программы разведения. Домашние мыши в учреждении, в котором они будут жить на протяжении всего эксперимента в течение как минимум 1 недели до прививки.ПРИМЕЧАНИЕ: Для репрезентативных результатов использовались 6-недельные самки мышей DBA2/N. Кормите животных чау без хлорофилла в течение не менее 7 дней до посева. 3. Эпиляция и прививка Индуцировать хирургическую плоскость анестезии (рисунок 1).ВНИМАНИЕ: Вдыхаемые анестетики являются опасными материалами и могут вызывать раздражение глаз или кожи, а также токсичность нервной системы. Необходимо соблюдать все институциональные политики и процедуры, а также общие лабораторные методы обеспечения безопасности при использовании ингаляционных анестетиков. Только лица, обученные использованию ингаляционных анестетиков, могут выполнять эти шаги. Стандартная практика включает в себя ношение перчаток, лабораторного халата, защиту глаз, использование системы падальщика анестезии и тщательный учет в соответствии с институциональными руководящими принципами.Поместите мышь в предварительно подогретую индукционную камеру анестезии. Держите животное в теплой обстановке во время общей анестезии. Сделайте это с помощью согревающих прокладок, предназначенных для этой цели, и нагретой ступени микроскопа. Не используйте безрецептурную грелку, так как она может перегреться и вызвать ожоги. Обеспечьте 2%-3% изофлурана в индукционную камеру до тех пор, пока мышь не потеряет свой корректирующий рефлекс и дыхание не будет медленным и устойчивым. Очистите индукционную камеру анестезии и переведите животное в неребризерный носовой конус, обеспечивающий 1%-2% изофлурана. Подтвердите плоскость анестезии с помощью рефлекса защемления пальца ноги или других механизмов проверки. На протяжении всего эксперимента контролируйте дыхательный паттерн животного и плоскость анестезии, а также регулируйте концентрацию анестетика по мере необходимости. Нанесите смазку для глаз, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Эпиляция (Рисунок 1C,D)Нанесите безрецептурный крем для депиляции обильно на внутреннюю и внешнюю поверхность обоих ушей с помощью тампона с ватным наконечником. Через 2-3 мин (или в соответствии с указаниями производителя) аккуратно протрите ухо сухой марлевой прокладкой, чтобы удалить весь крем и волосы. Протрите еще два раза марлевыми подушечками, насыщенными стерильной водой, чтобы полностью удалить остатки крема для депиляции. Неспособность удалить весь крем для депиляции приведет к раздражению кожи / воспалению. Инъекция (рисунок 1E, F)Протрите поверхность уха для введения марлевой прокладкой, пропитанной 70% этанолом и дайте высохнуть на воздухе. Хорошо перемешайте инокулятор, перевернув несколько раз или вихря. Введите 20-30 мкл инокулята в инсулиновый шприц. Удерживая иглу направленной вверх, осторожно постучите по шприцу, чтобы убедиться, что любой воздух в стволе находится наверху. Осторожно выбрасывайте воздух и избыток инокулята обратно в трубку инокулята или отработанную трубку, чтобы плунжер находился на отметке 10 мкл. Надев наперсток на палец или большой палец недоминирующей руки, стабилизируйте ухо, обернув его поперек наперстка. В качестве альтернативы, нанесите безрецептурную двустороннюю кожную ленту (модную ленту) на небольшую коническую пластиковую трубку с круглым дном и задрапируйте ухо поперек ленты. Позаботьтесь о том, чтобы при этом не выбить конус носа анестезии. Может быть полезно приклеить носовой конус к рабочей поверхности.ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя или внешняя сторона уха может быть введена в зависимости от физического комфорта исследователя. Для микроскопии обязательно поместите мышь так, чтобы сторона вводимого уха была обращена к объективу. Сохраняя шприцевую иглу почти полностью параллельно коже и избегая каких-либо крупных вен, вставьте кончик иглы в самый внешний слой кожи до тех пор, пока скос не будет просто покрыт. Медленно вводят инокулятор внутрикожно. Хорошая внутрикожная инъекция поднимет небольшой пузырь в коже. Держите иглу на месте в течение 15-20 с, прежде чем удалить ее из уха, чтобы свести к минимуму утечку.Если нижняя сторона уха животного становится влажной, игла оказывается слишком глубокой и проходит через ухо целиком. В этом случае повторите инъекцию в другой области уха. Повторите процесс, используя другое ухо животного. Это может быть сделано с теми же штаммами C. albicans для репликации или с другим набором штаммов C. albicans . Если это не визуализация немедленно, поместите животное в нагретую восстановительную камеру. Наблюдайте за животным, пока оно не оправится от анестезии, а затем верните его в клетку. Следуя институциональным протоколам, четко пометьте клетку метками биологической опасности и укажите, что животные в клетке заражены Candida albicans. Завершите все необходимые записи, связанные с анестезией животных и любой другой необходимой институциональной практикой. Размещайте животное в условиях животного объекта с использованием мер предосторожности уровня биологической безопасности животных 2. 4. Количественная оценка морфогенеза in vitro для сравнения с результатами in vivo Используя те же промытые культуры, которые использовались для приготовления инокулята, создают разбавление организмов 1:50 в RPMI1640 + 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотке и инкубируют при 37 °C с кувырканием в течение 4 ч. Альтернативно, могут быть использованы другие среды, которые стимулируют морфогенез in vitro . Центрифугируйте образец в течение 5 мин при 500 х г и повторно суспендируйте в 0,5 мл дПБС. Разбавьте образец в соотношении 1:10, поместите 2,5 мкл разбавленного образца на предметное стекло микроскопа и накройте его крышкой. Исследуйте образец с помощью флуоресцентного микроскопа. Подсчитайте не менее 100 клеток, регистрируя количество дрожжевых и нитевидных клеток для каждого штамма. В репрезентативных результатах, представленных здесь, нитевидная клетка определяется как любая клетка с длиной более чем в два раза превышающей длину материнской клетки.ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка морфогенеза in vitro может быть выполнена в тот же день, что и вакцинация животных. Можно инициировать анализ морфогенеза in vitro при подготовке инокулята к инъекции и выполнить инокуляцию животных в течение 4-часового инкубационного периода. Если все процедуры на животных завершены до окончания 4-часового инкубационного периода, приступают непосредственно к исследованию in vitro стимулированных клеток. Альтернативно, клетки могут быть повторно суспендированы в 3,7% формальдегиде в dPBS (на стадии 4.2) и храниться при 4 °C в течение нескольких дней. Фиксированные организмы затем могут быть количественно определены, как только позволит время. Прививка животных не должна задерживаться для количественного анализа in vitro . 5. Подготовка к визуализации in vivo Подготовьте микроскоп (рисунок 2А).Включите все оборудование для микроскопии и запустите программное обеспечение для визуализации.Если доступно, загрузите все предварительно определенные параметры образа. Активируйте лазеры и детекторы, необходимые для обнаружения используемых флуоресцентных белков. Включите нагретую ступень микроскопа и дайте ей нагреться до 37 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать микроскоп с полностью закрытой камерой окружающей среды, а не нагретой сценой. Установите контрольную точку оси Z, плоскость фокусировки которой находится на верхней поверхности крышки.  Это можно сделать, заклеив крышку на место над отверстием сцены и положив каплю воды на крышку.  Используйте «сухой» объектив с меньшим увеличением (10x), чтобы сфокусироваться на краю капли воды, а затем установите контрольную точку оси Z.  Используйте кусок полотенца, чтобы впитать воду из крышки, прежде чем снимать ее со сцены. Поверните объектив с очень большим рабочим расстоянием на место и поместите каплю погружной жидкости на объектив. Опустите линзу, чтобы избежать возможных повреждений при размещении крышки. Поместите крышку No1.5 на отверстие сцены и заклейте ее на место. Убедитесь, что лента полностью покрывает все края крышки, чтобы предотвратить попадание жидкости под крышкой в микроскоп. Поднимите объектив к исходной точке оси Z таким образом, чтобы иммерсионная жидкость соприкасалась как с объективом, так и с крышкой. Подготовьте несколько кусков чувствительной к давлению ленты, чтобы они были готовы к использованию при позиционировании носового конуса и мыши. Вызвать общую анестезию у мыши, чтобы она была изображена, как указано выше (шаг 3.1). Расположите мышь (рисунок 2B-D).Закрепите носовой конус анестезии на стадии микроскопа, расположив носовой конус так, чтобы он полностью закрывал нос животного, когда животное находится в положении для визуализации. Это может быть достигнуто легче с двумя исследователями. Попросите первого исследователя поместить нос анестезированной мыши в носовой конус и переместить мышь в положение для визуализации, продолжая держать носовой конус над носом животного. Попросите другого исследователя заклеить носовой конус и трубку на место, чтобы он стабильно сидел над носом мыши. Как только носовой конус будет заклеен на месте, оставьте его там на оставшуюся часть сеанса визуализации. Установив лучшее место для размещения носового конуса, обратите внимание на его положение. Для последующих сеансов визуализации носовой конус может быть закреплен на стадии, прежде чем привести животное к микроскопу. Поместите каплю стерильной воды на крышку над объективом. Поместите мышь на ступень микроскопа. Убедитесь, что ухо находится поверх капли воды и прилегает к крышке. Используйте вторую (верхнюю) крышку, чтобы сплющить ухо.Поместите край крышки параллельно телу мыши, при этом край коснется мыши там, где ухо встречается с головой. Опустите свободный край крышки на ступень микроскопа шарнирным движением. Когда крышка сталкивается со стадией микроскопа, она выравнивает ухо. Следите за тем, чтобы не создавать складок или гребней в ухе. Надежно закрепите верхнюю крышку на месте, чтобы она удерживала достаточное давление, чтобы сохранить ухо плоским. Следите за тем, чтобы не поймать шерсть мыши или усы в ленте. Если не используется микроскоп с камерой окружающей среды, свободно накройте тело мыши стерильной драпировкой для поддержания нормотермической среды. Определите интересующую область.Убедитесь, что цель находится в исходной точке оси Z. Используя белый свет / широкоугольную визуализацию, отрегулируйте плоскость фокусировки в ушной ткани. Хорошая стратегия заключается в том, чтобы сосредоточиться на кровеносных сосудах – если можно увидеть красные кровяные клетки, движущиеся в кровеносных сосудах, плоскость фокуса находится внутри ткани. Если микроскоп оснащен широкоугольной флуоресцентной способностью, используйте его для определения интересующей области. Если нет, используйте конфокальную визуализацию. В целом, использование широкоугольной микроскопии для выявления областей, представляющих интерес, происходит быстрее и требует меньшего облучения ткани уха.Используя фильтрующий куб для обнаружения флуоресцентного белка, экспрессируемого в эталонном штамме, идентифицируйте поле зрения, которое имеет флуоресцентный сигнал от эталонного штамма. Имейте в виду, что рассеянный свет, скорее всего, будет препятствовать способности фокусироваться на отдельных организмах. Целью этого шага является определение области, представляющей интерес для конфокальной визуализации. Перейдите на куб фильтра, который будет обнаруживать флуоресцентный белок, экспрессируемый экспериментальным штаммом (штаммами), и проверять их присутствие в выбранном поле зрения. 6. Визуализация Определите параметры.В то время как программное обеспечение для визуализации находится в реальном конфокальном режиме, изучите область интересов, когда фокальная плоскость перемещается через ось Z. Выберите плоскость оси Z с сильным сигналом от всех используемых флуоресцентных белков. Отрегулируйте мощность лазера и/или скорость визуализации для получения достаточно сильного сигнала таким образом, чтобы морфология могла быть определена для всех клеток в поле зрения. Чтобы избежать повреждения тканей, используйте минимально возможную мощность лазера.ПРИМЕЧАНИЕ: Как и во всех изображениях, существует баланс между мощностью лазера, скоростью захвата и разрешением. Определите настройки, которые четко идентифицируют морфологию организма, балансируя скорость и мощность лазера, чтобы свести к минимуму облучение ткани уха. Поскольку визуализация происходит через внешнюю дерму, для возбуждения требуется более высокая мощность лазера, чем обычно необходима для конфокальной визуализации традиционных образцов, установленных на слайдах. К счастью, уровень пространственного разрешения, необходимый для анализа морфологии, не является экстремальным. Таким образом, получение изображений с достаточным сигналом для определения морфологии организма без повреждения тканей легко достижимо. Как только эти параметры установлены, используйте их на протяжении всего сеанса визуализации, чтобы служить отправной точкой для последующих сеансов визуализации. Таким образом, полезно сохранить настройки изображения.ПРИМЕЧАНИЕ: Отдельные области инфекции могут быть более мелкими или более глубокими в ткани. Более глубокие области могут потребовать увеличения мощности лазера. Поскольку этот анализ опирается на пространственное распределение сигнала, а не на его интенсивность, допустимо изменять настройки изображения между полями по мере необходимости. Получите изображения.Выберите поле зрения, которое имеет четкое образование нитей в эталонном штамме и где большинство организмов распределены настолько, что их морфология может быть определена. Установите верхнюю и нижнюю плоскости фокусировки для z-стека. Нет необходимости охватывать всю глубину зараженной области, но имейте в виду, что организмы в верхней или нижней части изображенного объема обычно исключаются из анализа. Получайте изображения z-стека, псевдоцветите каждый канал, чтобы различать каждый штамм, и накладывайте каналы. Сохраните изображения. Повторите для других полей зрения. Морфогенез может варьироваться от местоположения к месту; поэтому важно получить и проанализировать по крайней мере три поля из каждого уха. 7. Ручной двумерный анализ: частота нити накаливания Используйте программное обеспечение для обработки изображений для выполнения максимальной проекции z-стека в двумерное изображение. Инструкции, приведенные здесь, предназначены для FIJI/Image J.Открывайте микроскопические изображения с помощью программного обеспечения ImageJ. При необходимости нанесите псевдоцвет на каждый канал, чтобы обеспечить прямую идентификацию каждого штамма C. albicans . Для этого нажмите на Image > Lookup Table > LUT Color и выберите выбранный псевдоцвет. Преобразуйте стековый файл в двухмерное изображение проекции максимальной интенсивности:Выберите файл z-stack. Нажмите на Image > Stacks > Z Projection. Выберите верхнюю и нижнюю плоскость и выберите тип проекции Max Intensity. Подсчитайте каждый организм, видимый на максимальных проекционных изображениях, по типу штамма (различаемому по цвету канала) и морфологии.Организмы, которые значительно перекрывают друг друга или области с очень высокой плотностью организма, будет трудно точно подсчитать. Исключите их из подсчета, но позаботьтесь о том, чтобы не вводить смещение в отношении нитевидных форм, которые с большей вероятностью будут перекрываться. Нитевидные формы, выступающие прямо в z-стек или из него, будут выглядеть как небольшие круглые объекты в максимальной проекции. Аналогичным образом, организмы, которые отрезаны границей изображения, могут казаться дрожжами, потому что нить находится вне поля зрения. Таким образом, двумерный анализ всегда будет переоценивать процент дрожжевых форм. Поскольку это будет происходить наравне с эталонным и экспериментальным штаммом (штаммами), всегда сравнивайте экспериментальные результаты с результатами эталонного штамма. Выполняйте статистические сравнения результатов в соответствии с экспериментальной конструкцией. 8. Ручной двумерный анализ: длина нити накала Для C. albicans образование аберрантных нитей может происходить потому, что: а) меньше «материнских» дрожжевых клеток подвергаются морфогенезу, б) нити растут медленнее или в) нитевидный рост инициируется, но не поддерживается. Чтобы оценить эти возможности, количественно оцените длину кривого пути каждой нити накала в максимальном проекционном изображении в качестве суррогата истинной трехмерной длины (обсуждается ниже).Когда почка развивается на материнской клетке, невозможно сказать, станет ли она нитью или дрожжами. Чтобы убедиться, что в этот анализ включены только нитевидные клетки, измеряйте только организмы, в которых дочерняя клетка по крайней мере в два раза длиннее материнской клетки. Откройте максимальное проекционное изображение, созданное на шаге 7. В наборе инструментов ImageJ щелкните правой кнопкой мыши инструмент «Прямая/сегментированная линия» и выберите параметр «Сегментированная линия». Опция сегментированной линии позволяет пользователю измерять длину нити накала вдоль изогнутого пути, что необходимо, учитывая пластичность нитей C. albicans . Измерьте длину нити от шейки бутона до растущего конца нити. Щелкните левой кнопкой мыши на шейке бутона; указатель изменится на небольшой квадрат. Проследите нить накала по ее длине, щелкая по центру нити накала каждый раз, когда происходит кривая, поворот или изменение длинной оси нити накала. Дважды щелкните по растущему кончику нити накала. Управление нажатием + M. Откроется всплывающее окно, в котором будут сведены в таблицу измерения площади, среднего, минимального, максимального значения и длины. После измерения каждой нити накала еще раз нажмите Control + M, чтобы добавить текущее измерение в таблицу измерений. Когда все нити будут измерены, скопируйте и вставьте измерения длины в файл анализа данных. Выполните статистический анализ для оценки распределения длин нитей в эталонном штамме и мутантном штамме. 9. Ручной трехмерный анализ Чтобы получить более точное измерение морфогенеза, которое позволяет избежать переоценки дрожжевых форм и может позволить различать псевдогифы и гифы, вручную прокрутите вверх и вниз через z-стек, оценивая морфологию каждого организма в трех измерениях. Кроме того, можно создать трехмерное изображение каждого z-стека и проанализировать форму каждого организма при вращении изображения. 10. Автоматизированный анализ Используя программное обеспечение для визуализации, автоматизируйте перечисление организмов и их морфологию в двух или трех измерениях.ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые алгоритмы для различения типов морфологии могут вводить предвзятость. Таким образом, стратегии автоматизации должны быть тщательно проверены по отношению к экспериментальному проектированию. Хорошо спроектированный и проверенный автоматизированный анализ изображений может увеличить пропускную способность этапа анализа.