Bu makalede, non-invaziv konfokal mikroskopi kullanılarak bir memeli konakçısında aktif enfeksiyon sırasında morfogenez fenotipleri için orta büyüklükte Candida albicans mutant kütüphanelerinin taranması için bir yöntem anlatılmaktadır.
Candida albicans önemli bir insan patojenidir. Morfolojik formlar arasında geçiş yapabilme yeteneği, patogenezinin merkezindedir; Bu morfolojik değişiklikler, çevresel uyaranlara yanıt olarak kontrol edilen karmaşık bir sinyal ağı tarafından düzenlenir. Bu düzenleyici bileşenler oldukça çalışılmıştır, ancak hemen hemen tüm çalışmalar filamentasyonu tetiklemek için çeşitli in vitro uyaranlar kullanmaktadır. Patogenez sürecinde morfogenezin nasıl düzenlendiğini belirlemek için, memeli konakçısında hifal oluşumu geçiren organizmaların yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntülerini elde etmek için bir in vivo mikroskopi sistemi geliştirdik. Burada sunulan protokol, bu sistemin C. albicans mutant suşlarının küçük koleksiyonlarını taramak için kullanımını açıklamakta ve enfeksiyon bölgesinde meydana gelen morfogenezin anahtar düzenleyicilerini tanımlamamıza izin vermektedir. Transkripsiyonel regülatör Efg1 gibi bazı morfogenez düzenleyicilerinin in vitro ve in vivo tutarlı fenotiplere sahip olduğunu, oysa adenil siklaz (Cyr1) gibi diğer düzenleyicilerin in vitro’ya kıyasla in vivo olarak anlamlı derecede farklı fenotiplere sahip olduğunu gösteren temsili sonuçlar sunulmuştur.
Candida albicans, mukokutanöz hastalığa, yayılmış hastalığa ve lokalize doku enfeksiyonlarına neden olan yaygın bir insan mantar patojenidir1. C. albicans fizyolojisinin önemli bir özelliği, hem kommensal hem de patojen 2,3,4 olarak rolüyle bağlantılı olan karmaşık polimorfik büyümesidir. 30 ° C’de in vitro zengin besin koşulları altında, tipik olarak oval tomurcuklanan bir maya olarak büyür. Besin yoksunluğu, pH değişiklikleri, 37 ° C’de büyüme, seruma maruz kalma ve agar’a gömüldüğünde büyüme dahil olmak üzere çeşitli çevresel tetikleyiciler, polarize bir büyüme modeline geçişle sonuçlanır ve gerçek hiflerin ve / veya psödohifaların oluşumuna neden olur5. Polarize büyümenin başlaması ve bunun sonucunda filamentli organizmaların büyümesi morfogenez olarak adlandırılır.
Morfogenezin organizmanın virülansındaki önemi nedeniyle, hifal oluşumunun düzenlenmesi kapsamlı bir şekilde incelenmiştir 6,7. Morfogenezi tetikleyen karmaşık bir sinyal yolları ve transkripsiyonel düzenleme ağı vardır. C. albicans morfogenezinin patogenez ile ilişkisine rağmen, morfogenezi araştıran çoğu çalışmada hifal oluşumunu tetiklemek için in vitro uyaranlar kullanılmıştır. Çeşitli in vitro filamentasyon modellerinin, uyarılan bireysel düzenleyici yollar açısından aynı olmadığı giderek daha açık hale gelmektedir. Ayrıca, in vitro büyüme koşulları, konağın karmaşık ortamına sıkı sıkıya karşılık gelmez. C. albicans’ın bir insan patojeni olarak önemi göz önüne alındığında, bu protokolün amacı, bir memeli konakçısında aktif enfeksiyon sırasında morfogenezini orta derecede verime sahip bir sistem kullanarak araştırmak ve böylece bir araştırmacının C. albicans mutant kütüphanelerini taramasına izin vermektir.
Bu araştırmaları kolaylaştırmak için, ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop 8,9,10 kullanılarak anestezi uygulanmış bir farenin pinnasının enfeksiyonu sırasında C. albicans hücrelerinin yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntülerini elde etmemizi sağlayan bir in vivo görüntüleme sistemi geliştirilmiştir. İğnenin derisi oldukça ince olduğu için doku diseksiyonuna gerek kalmadan bu görüntüler elde edilebilir. Böylece, kantitatif fenotip verileri, konakçı doku içindeki aktif enfeksiyonların bulunduğu yerde ölçülebilir. Burada açıklanan protokol, bir referans suşun ve farklı floresan protein ekspresyon kasetleri11,12 ile bir veya daha fazla mutant suşun dönüşümünü içerir. Floresan protein eksprese eden suşlar daha sonra karıştırılır ve intradermal olarak birlikte enjekte edilir. Enfeksiyon kurulduktan sonra, hem filamentasyon sıklığını hem de oluşan filamentlerin uzunluğunu ölçmek için konfokal görüntüleme kullanılır. Mutant suşlardan elde edilen veriler, aynı doku bölgesinde bulunan referans suştan elde edilene normalleştirilerek iç kontrol sağlanır. Bu sistem, birçoğu in vitro 9,10 morfogenez defektlerine sahip birkaç dizi C. albicans mutant suşunu başarıyla taramamızı sağlamıştır. Bu suşların birçoğu in vivo olarak kolayca filament yaparak, morfogenezin araştırılması için in vivo modellerin önemini vurgulamaktadır.
Bu model, bir memeli konağının dokusu içinde büyürken C. albicans organizmalarının görüntülerini elde etmek için konfokal mikroskopi kullanır, böylece aktif enfeksiyon sırasında morfogenez fenotiplerini değerlendirmemize izin verir. Morfogenez süreci C. albicans patogenezinin merkezindedir ve çeşitli in vitro tahliller 2,3,4 kullanılarak yaygın olarak incelenmiştir. Bununla birlikte, hiçbir in vitro test, konağın karmaşık biyokimyasal ve yapısal ortamını tam olarak modelleyemez.
Burada açıklanan protokol, enfeksiyon sırasında morfogenezde rol oynayan genleri tanımlamak için C. albicans mutantlarının bir serisini / kütüphanesini taramak için bu in vivo görüntüleme sisteminin kullanımına odaklanmıştır. Farklı floresan proteinleri ifade eden C. albicans suşlarının kullanımı, C. albicans mutant suşlarının in vivo morfogenezini referans suşunkine kıyasla ölçmemizi sağlar. Mutanttaki morfogenezi aynı enfeksiyon alanındaki referans suşu ile karşılaştırmak, organizmaların aynı ortamlara maruz kalmasını sağlar. Bu, filamentasyona tabi tutulan hücrelerin yüzdesinin ve filamentasyonun kapsamının nicel olarak ölçülmesini sağlar. Mutant suş(lar)ın ölçümlerinin referans suşunkilerle normalleştirilmesi, bir mutantın performansını diğeriyle daha iyi karşılaştırmamızı sağlar.
Burada sunulan temsili sonuçlar, in vitro ve in vivo fenotipler arasında önemli bir tutarsızlık potansiyelini göstermektedir. C. albicans efg1ΔΔ mutant suşu genellikle morfogenez testleri için negatif bir kontrol olarak kullanılır, çünkü hemen hemen tüm in vitro koşullarda filament yapamaz20. İn vivo sonuçlar in vitro sonuçlara çok benzer olmasına rağmen, bu ciddi şekilde engellenmiş suş bile zaman zaman konakçı doku ortamında filamentler oluşturmuştur (Şekil 3). Bu, morfogenezi tetiklemede konakçı ortamın gücünü vurgular.
Buna karşılık, cyr1ΔΔ mutant suşu, in vitro ve in vivo büyüme arasında önemli bir uyumsuzluk gösterir; mutant hücrelerin hiçbiri in vitro filamentasyona uğramasa da, hücrelerin yaklaşık yarısı in vivo filamentler halinde büyür (Şekil 4)10,21. İlginç bir şekilde, bu filamentler referans suşu tarafından oluşturulanlardan önemli ölçüde daha kısaydı, bu da CYR1’in filament büyüme hızına veya filamentli bir fenotipi sürdürme yeteneğine katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. Filament uzunluğunun analizini kolaylaştırmak için, filamentlerin eğri yol uzunluğu, görüntülerin iki boyutlu bir projeksiyonu kullanılarak ölçülmüştür. Üç boyutlu büyüyen filamentlerin iki boyutlu projeksiyonlarında, xy düzlemine paralel olmayan bir eksende büyüyen herhangi bir filament, gerçek uzunluğundan daha kısa olarak yansıtılacaktır. Bu ön kısalma, referans suşu için de meydana geldiğinden, filament uzunluklarının iki boyutlu bir projeksiyondaki dağılımını değerlendirmek, referans ve mutant suşlar arasında nicel bir karşılaştırmaya izin verir. Filament uzunluğunun üç boyut yerine iki boyutta analizi daha az yoğun görüntü analizi gerektirir; Böylece, tipik bir masaüstü bilgisayarda nispeten hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir. Bu daha basit analizin kullanılması, filament uzunluğu dağılımının bir tarama protokolünün bir parçası olarak dahil edilmesine izin verir ve her mutantın verimde önemli gecikmelere neden olmadan morfogenez geçirme kabiliyetinin daha nüanslı bir şekilde anlaşılmasını sağlar.
Burada sunulan temsili çalışmalar, kompleman sistemlerinde nötrofillerin C. albicans enfeksiyonu22 bölgesine alınamamasına neden olan bir kusuru olan DBA2 / N fareleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmaların amacı, konakçı doku içinde C. albicans filamentasyonunun regülasyon mekanizmalarını araştırmaktır. Bu nedenle, DBA2 / N fareleri, bireysel bir suşun nötrofillere duyarlılığı veya direnci nedeniyle sonuçların karıştırılmasını önlemek için kullanılmıştır. Nötrofil anti-C. albicans yanıtı filamentasyon23’ü etkileyebildiğinden, enfeksiyon bölgesine nötrofil alımı bir morfogenez testinin sonuçlarını etkileyebilir. Bir suş in vivo filamentleme yeteneğine sahipse, ancak nötrofiller mevcut olduğunda filamentasyondan güçlü bir şekilde inhibe edilirse, DBA2 / N farelerde filamentasyon tespit edilir, ancak bozulmamış nötrofil kemotaksisli fareler kullanılırken görülmesi olası değildir. Bu nedenle, konakçı olarak kullanılan farenin gerginliği, bu protokolü kullanırken önemli bir faktördür.
Efg1ΔΔ mutant suşunun in vivo filamentte başarısız olduğu gözleminin, konakçı nötrofil tepkileriyle ilişkili olması muhtemel değildir, çünkü bu suş da in vitro filamentte başarısız olur. Cyr1ΔΔ suşu ile in vivo olarak gözlenen filamentasyon, in vitro filamentasyona uymaması nedeniyle uyumsuzdur. C. albicans enfeksiyonunun zebra balığı modelinden elde edilen veriler, yanıt veren nötrofillerin morfogenez24’ün önlenmesinde önemli olduğunu göstermektedir. Bu nedenle, nötrofil yanıtlarından yoksun olan DBA2 / N farelerinin kullanımının, in vitro’ya kıyasla cyr1ΔΔ’nun in vivo filamentasyonundaki artışı hesaba katması muhtemel değildir. Bununla birlikte, in vivo ortam, cyr1ΔΔ suşunun morfogenezini açıkça etkilemektedir; Bu nedenle, bu suşun daha fazla araştırılması, aktif enfeksiyonlar sırasında C. albicans morfogenezinin düzenlenmesi hakkında önemli bilgiler sağlayabilir. Burada açıklanan protokol, gelecekteki çalışmalarda kullanılacak cyr1ΔΔ suşu gibi suşları tanımlamak için bir tarama testi olarak tasarlanmıştır.
Düşük akışlı gaz anestezi sisteminin kullanılması bu protokol için çok yararlıdır (Şekil 1A,B). Bu protokolün ilk gelişimi sırasında, fareler ksilazin ile karıştırılmış enjekte edilebilir bir ketamin anestezik kokteyli kullanılarak anestezi altına alındı. Bu anestezik yöntemle sınırlı görüntüleme yapmak mümkün olsa da, anestezi süresi tahmin edilemezdi, bu da görüntüleme sırasında farenin anesteziden iyileşmesini önlemek için görüntüleme seanslarının hızlı bir şekilde sonlandırılmasını gerektiriyordu. Geleneksel inhale anestezik sistemler hantaldır ve genellikle bir duman davlumbazında kullanılmalarını gerektiren yüksek oranda anestezik gaz akışı gerektirir. Bu nedenle, geleneksel inhale anestezik sistemlerin, araştırmacıları yanlışlıkla anestezik ajanlara maruz bırakmadan konfokal bir mikroskobun alan kısıtlamaları ile kullanılması çok zor olacaktır. Düşük akışlı inhale anestezik sistemin kullanılması, araştırmacı için güvenli bir ortam sağlarken hayvanın tutarlı anestezisine izin verir. Düşük akışlı burun konisi, hayvanın hem aşılama hem de mikroskopi için kolay konumlandırılmasını sağlar. Küçük kalibreli, düşük hacimli dağıtım borusu, anestezi makinesinin mikroskopiye müdahale etmemek için yeterli bir mesafeye yerleştirilmesini sağlayan nispeten uzun tüplerin kullanılmasına izin verir.
Tipik fare chow’unda bulunan klorofil, önemli doku otofloresansına yol açar25. Bu, görüntülerde önemli miktarda parazit oluşturarak yüksek kaliteli, yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüler elde etmeyi zorlaştırır. Hayvanlara görüntülemeden önceki 7 gün boyunca klorofil içermeyen chow beslendiğinde, otofloresanın arka planı dokuda önemli ölçüde azaldı, ancak saçta biriken klorofil sorunlu olmaya devam etti. Reçetesiz satılan kimyasal tüy dökücü krem kullanılarak pinnadaki saçların çıkarılması, saçtaki otofloresansı en aza indirmede etkilidir (Şekil 1C,D). Böylece, klorofil içermeyen chow ve yeterli epilasyon kombinasyonu, otofloresanı önemli ölçüde azalttı ve görüntü kalitesini önemli ölçüde artırdı. Görüntüleme öncesinde saçlar kulaktan çıkarıldığı için hayvanın saçının rengi bu sistemi etkilemez. Bu protokol, BALB / c (beyaz), C57BL / 6 (siyah) ve DBA2 / N (kahverengi) farelerde C. albicans enfeksiyonlarını incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Protokol, çeşitli konakçı genlerinde eksik olan C57BL / 6 nakavt fareleri ile de kullanılabilir; Bu, memeli konakçı bağışıklık sisteminin filamentasyonu nasıl etkilediğine dair gelecekteki araştırmalara izin verecektir. Bu modelin bu protokolde tartışılmayan bir özelliği, bu görüntüleme sistemi invaziv olmadığı için, aynı hayvanın birkaç gün boyunca tekrar tekrar görüntülenebilmesi ve zaman içinde bireysel enfeksiyonun ilerlemesini takip etmesine izin vermesidir. Bu özellik, konakçı-patojen etkileşimi üzerine gelecekteki çalışmalarda önemli bir rol oynayacaktır.
Özetle, bu protokol, canlı bir memeli konağının dokusunda büyüyen C. albicans’ın yüksek uzamsal çözünürlüklü görüntüleriyle sonuçlanır ve mutant suşlarda morfogenezin doğru bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır 8,9,10. Burada sunulan sonuçlar, bu protokolün C. albicans mutantlarının bir kütüphanesini taramak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bugüne kadar test edilen C. albicans mutantlarından, in vitro morfogenezde bilinen kusurları olan mutantların büyük bir kısmı kolayca in vivo 9,10 filamentasyona uğrar. Bu, C. albicans patogenezinin mekanizmalarını aydınlatmak için tasarlanmış deneylere bunun gibi bir in vivo sistemin dahil edilmesinin önemini vurgulamaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH hibe 1R01AI33409 ve Iowa Üniversitesi Carver Tıp Fakültesi, Pediatri Bölümü tarafından desteklenmiştir.
#1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
Isoflurane | Akorn | J119005 | |
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |