Dit manuscript beschrijft een methode voor het screenen van middelgrote Candida albicans mutante bibliotheken op morfogenese fenotypes tijdens actieve infectie in een zoogdier gastheer met behulp van niet-invasieve confocale microscopie.
Candida albicans is een belangrijke ziekteverwekker bij de mens. Het vermogen om te schakelen tussen morfologische vormen staat centraal in de pathogenese; deze morfologische veranderingen worden gereguleerd door een complex signaleringsnetwerk dat wordt aangestuurd als reactie op omgevingsstimuli. Deze regulerende componenten zijn zeer bestudeerd, maar bijna alle studies gebruiken een verscheidenheid aan in vitro stimuli om filamentatie te activeren. Om te bepalen hoe morfogenese wordt gereguleerd tijdens het pathogeneseproces, hebben we een in vivo microscopiesysteem ontwikkeld om beelden met een hoge ruimtelijke resolutie te verkrijgen van organismen die hyphale vorming ondergaan in de gastheer van het zoogdier. Het hier gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van dit systeem om kleine verzamelingen van C. albicans mutante stammen te screenen, waardoor we de belangrijkste regulatoren van morfogenese kunnen identificeren zoals deze optreedt op de plaats van infectie. Er worden representatieve resultaten gepresenteerd die aantonen dat sommige regulatoren van morfogenese, zoals de transcriptionele regulator Efg1, consistente fenotypen in vitro en in vivo hebben, terwijl andere regulatoren, zoals adenylcyclase (Cyr1), in vivo significant verschillende fenotypen hebben in vergelijking met in vitro.
Candida albicans is een veel voorkomende menselijke schimmelpathogeen, die mucocutane ziekte, gedissemineerde ziekte en gelokaliseerde weefselinfecties veroorzaakt1. Een belangrijk kenmerk van de fysiologie van C. albicans is de complexe polymorfe groei, die verband houdt met zijn rol als zowel een commensale als een pathogeen 2,3,4. Onder rijke voedingscondities in vitro bij 30 °C groeit het meestal als een eivormige ontluikende gist. Een verscheidenheid aan omgevingstriggers, waaronder nutriëntengebrek, pH-veranderingen, groei bij 37 °C, blootstelling aan serum en groei wanneer ingebed in agar, resulteren in de overgang naar een gepolariseerd groeipatroon, wat resulteert in de vorming van echte schimmeldraden en / of pseudohyphae5. Het initiëren van gepolariseerde groei en de daaruit voortvloeiende groei van filamenteuze organismen wordt morfogenese genoemd.
Vanwege het belang van morfogenese in de virulentie van het organisme, is de regulatie van hyphale vorming uitgebreid bestudeerd 6,7. Er is een complex netwerk van signaalroutes en transcriptionele regulatie dat morfogenese veroorzaakt. Ondanks de relatie van C. albicans morfogenese met pathogenese, hebben de meeste studies die morfogenese onderzoeken in vitro stimuli gebruikt om hyphale vorming te veroorzaken. Het wordt steeds duidelijker dat de verschillende in vitro modellen van filamentatie niet identiek zijn in termen van de individuele regulatoire routes die worden gestimuleerd. Bovendien komen geen in vitro groeiomstandigheden nauw overeen met de complexe omgeving van de gastheer. Gezien het belang van C. albicans als een menselijke ziekteverwekker, is het doel van dit protocol om de morfogenese ervan te onderzoeken tijdens actieve infectie in een zoogdiergastheer met behulp van een systeem met matige doorvoer, waardoor een onderzoeker C. albicans mutant bibliotheken kan screenen.
Om deze onderzoeken te vergemakkelijken, werd een in vivo beeldvormingssysteem ontwikkeld waarmee we beelden met een hoge ruimtelijke resolutie van C. albicans-cellen kunnen verkrijgen tijdens infectie van de pinna van een verdoofde muis met behulp van een omgekeerde confocale microscoop 8,9,10. Omdat de huid van de pinna vrij dun is, kunnen deze beelden worden verkregen zonder dat weefseldissectie nodig is. Zo kunnen kwantitatieve fenotypegegevens worden gemeten op de plaats van actieve infecties in het gastheerweefsel. Het hier beschreven protocol omvat de transformatie van een referentiestam en een of meer mutante stammen met verschillende fluorescerende eiwitexpressiecassettes11,12. De fluorescerende eiwitexpressiestammen worden vervolgens gemengd en gelijktijdig intradermaal geïnjecteerd. Nadat de infectie is vastgesteld, wordt confocale beeldvorming gebruikt om zowel de frequentie van filamentatie als de lengte van de gevormde filamenten te kwantificeren. De gegevens verkregen van de mutante stammen worden genormaliseerd tot die verkregen uit de referentiestam, die in hetzelfde weefselgebied aanwezig is, waardoor een interne controle wordt geboden. Dit systeem heeft ons in staat gesteld om met succes verschillende series C. albicans mutante stammen te screenen, waarvan er vele morfogenesedefecten hebben in vitro 9,10. Veel van deze stammen filamenten gemakkelijk in vivo, wat het belang van in vivo modellen voor het onderzoek naar morfogenese benadrukt.
Dit model maakt gebruik van confocale microscopie om beelden te verkrijgen van C. albicans-organismen terwijl ze groeien in het weefsel van een zoogdiergastheer, waardoor we morfogenesefenotypen tijdens actieve infectie kunnen evalueren. Het proces van morfogenese staat centraal in de pathogenese van C. albicans en is op grote schaal bestudeerd met behulp van een verscheidenheid aan in vitro assays 2,3,4. Geen enkele in vitro test kan echter de complexe biochemische en structurele omgeving van de gastheer volledig modelleren.
Het hier beschreven protocol is gericht op het gebruik van dit in vivo beeldvormingssysteem om een reeks / bibliotheek van C. albicans-mutanten te screenen om de genen te identificeren die betrokken zijn bij morfogenese tijdens infectie. Het gebruik van C. albicans-stammen die verschillende fluorescerende eiwitten tot expressie brengen, stelt ons in staat om in vivo morfogenese van C. albicans mutante stammen te kwantificeren in vergelijking met die van een referentiestam. Het vergelijken van morfogenese in de mutant met de referentiestam binnen hetzelfde infectiegebied zorgt ervoor dat de organismen worden blootgesteld aan identieke omgevingen. Dit maakt kwantitatieve meting mogelijk van het percentage cellen dat filamentatie ondergaat, evenals de mate van filamentatie. Normalisatie van de metingen van de mutante stam(en) ten opzichte van die van de referentiestam stelt ons in staat om de prestaties van de ene mutant beter met de andere te vergelijken.
De hier gepresenteerde representatieve resultaten tonen het potentieel aan voor een significante discrepantie tussen in vitro en in vivo fenotypen. De C. albicans efg1ΔΔ mutante stam wordt vaak gebruikt als een negatieve controle voor morfogenese-assays omdat het in bijna alle in vitro omstandigheden nietfilamenteert 20. Hoewel de in vivo resultaten sterk leken op de in vitro resultaten, vormde zelfs deze ernstig belemmerde stam af en toe filamenten in de gastheerweefselomgeving (figuur 3). Dit benadrukt de kracht van de gastheeromgeving bij het activeren van morfogenese.
Daarentegen vertoont de cyr1ΔΔ mutante stam een aanzienlijke discrepantie tussen in vitro en in vivo groei; hoewel geen van de mutante cellen in vitro filamentatie ondergaat, groeit ongeveer de helft van de cellen in vivo als filamenten (figuur 4)10,21. Interessant is dat deze filamenten significant korter waren dan die gevormd door de referentiestam, wat suggereert dat CYR1 bijdraagt aan de snelheid van filamentgroei of het vermogen om een filamenteus fenotype te behouden. Om de analyse van de filamentlengte te vergemakkelijken, werd de lengte van het curvepad van de filamenten gemeten met behulp van een tweedimensionale projectie van de afbeeldingen. In tweedimensionale projecties van filamenten die in drie dimensies groeien, zal elk filament dat groeit op een as die niet evenwijdig is aan het xy-vlak, net zo korter projecteren dan zijn werkelijke lengte. Aangezien deze foreshortening ook voorkomt voor de referentiestam, maakt het evalueren van de verdeling van filamentlengtes in een tweedimensionale projectie nog steeds een kwantitatieve vergelijking mogelijk tussen de referentie- en mutante stammen. Analyse van filamentlengte in twee in plaats van drie dimensies vereist minder intensieve beeldanalyse; het kan dus relatief snel worden uitgevoerd op een typische desktopcomputer. Het gebruik van deze eenvoudigere analyse maakt het mogelijk om filamentlengteverdeling op te nemen als onderdeel van een screeningprotocol, waardoor een genuanceerder inzicht ontstaat in het vermogen van elke mutant om morfogenese te ondergaan zonder aanzienlijke vertragingen in de doorvoer te veroorzaken.
De hier gepresenteerde representatieve studies werden uitgevoerd met behulp van DBA2/N-muizen, die een defect in hun complementsysteem hebben waardoor neutrofielen niet worden gerekruteerd naar de plaats van C. albicans-infectie 22. Het doel van deze studies was om mechanismen van de regulatie van C. albicans filamentatie in het gastheerweefsel te onderzoeken. Daarom werden DBA2/N-muizen gebruikt om te voorkomen dat de resultaten in de war raakten vanwege de gevoeligheid of resistentie van een individuele stam tegen neutrofielen. Aangezien de neutrofiele anti-C. albicans-respons de filamentatie kan beïnvloeden23, kan neutrofielenrekrutering naar de plaats van infectie de resultaten van een morfogenesetest beïnvloeden. Als een stam in staat is om in vivo te filamenteren, maar sterk wordt geremd door filamentatie wanneer neutrofielen aanwezig zijn, zou filamentatie worden gedetecteerd in DBA2 / N-muizen, maar zou het onwaarschijnlijk zijn dat het wordt gezien bij het gebruik van muizen met intacte neutrofiele chemotaxis. De stam van de muis die als gastheer wordt gebruikt, is dus een belangrijke factor bij het gebruik van dit protocol.
De waarneming dat de efg1ΔΔ mutante stam niet in vivo filamenteert, is waarschijnlijk niet gerelateerd aan gastheerneurtrofiele reacties, omdat deze stam ook niet in vitro filamenteert. De filamentatie die in vivo wordt waargenomen met de cyr1ΔΔ-stam is discordant met het falen van filamentatie in vitro. Gegevens van het zebravismodel van C. albicans-infectie geven aan dat reagerende neutrofielen belangrijk zijn bij de preventie van morfogenese24. Daarom is het onwaarschijnlijk dat het gebruik van DBA2/N-muizen, die geen neutrofiele responsen hebben, de toename van de filamentatie van de cyr1ΔΔ in vivo in vergelijking met in vitro verklaart. Niettemin heeft de in vivo omgeving duidelijk invloed op de morfogenese van de cyr1ΔΔ-stam; verder onderzoek van deze stam kan dus belangrijke informatie opleveren over de regulatie van C. albicans morfogenese tijdens actieve infecties. Het hier beschreven protocol is ontworpen als een screeningstest om stammen zoals de cyr1ΔΔ-stam te identificeren die in toekomstige studies zullen worden gebruikt.
Het gebruik van een low-flow gas anesthesiesysteem is zeer nuttig voor dit protocol (figuur 1A,B). Tijdens de eerste ontwikkeling van dit protocol werden muizen verdoofd met behulp van een injecteerbare anesthetische cocktail van ketamine gemengd met xylazine. Hoewel het mogelijk was om beperkte beeldvorming uit te voeren met die anesthesiemethode, was de duur van de anesthesie onvoorspelbaar, waardoor beeldvormingssessies snel moesten worden beëindigd om te voorkomen dat de muis tijdens de beeldvorming herstelde van anesthesie. Traditionele geïnhaleerde anesthetische systemen zijn omvangrijk en vereisen hoge stroomsnelheden van anesthetische gassen, waardoor ze vaak in een zuurkast moeten worden gebruikt. Traditionele geïnhaleerde anestheticasystemen zouden dus zeer moeilijk te gebruiken zijn met de ruimtebeperkingen van een confocale microscoop zonder de onderzoekers per ongeluk bloot te stellen aan de anesthetica. Het gebruik van een low-flow geïnhaleerd anestheticumsysteem maakt consistente anesthesie van het dier mogelijk met behoud van een veilige omgeving voor de onderzoeker. De low-flow nosecone maakt een eenvoudige positionering van het dier mogelijk voor zowel inenting als microscopie. De kleine kaliber, low-volume delivery tubing maakt het gebruik van relatief lange buizen mogelijk, waardoor het anesthesieapparaat op voldoende afstand kan worden geplaatst om microscopie niet te verstoren.
Het chlorofyl dat aanwezig is in typische muizen chow leidt tot significante weefselautofluorescentie25. Dit zorgt voor aanzienlijke ruis in de beelden, waardoor het moeilijk is om beelden van hoge kwaliteit en een hoge ruimtelijke resolutie te verkrijgen. Wanneer dieren gedurende 7 dagen voorafgaand aan beeldvorming chlorofylvrije chow kregen, was de achtergrond van autofluorescentie aanzienlijk afgenomen in weefsel, maar chlorofyl afgezet in het haar bleef problematisch. Het verwijderen van het haar op de pinnae met behulp van een vrij verkrijgbare chemische ontharingscrème is effectief in het minimaliseren van autofluorescentie in het haar (figuur 1C, D). De combinatie van chlorofylvrije chow en adequate ontharing verminderde dus aanzienlijk de autofluorescentie en verbeterde de beeldkwaliteit dramatisch. Omdat het haar uit het oor wordt verwijderd voorafgaand aan de beeldvorming, heeft de kleur van het haar van het dier geen invloed op dit systeem. Dit protocol is met succes gebruikt om C. albicans-infecties te bestuderen bij BALB / c (wit), C57BL / 6 (zwart) en DBA2 / N (bruine) muizen. Het protocol kan ook worden gebruikt met C57BL/6 knock-out muizen die een tekort hebben aan verschillende gastheergenen; dit zal toekomstige onderzoeken mogelijk maken naar hoe het immuunsysteem van de gastheer van zoogdieren de filamentatie beïnvloedt. Een kenmerk van dit model dat niet in dit protocol wordt besproken, is dat, omdat dit beeldvormingssysteem niet-invasief is, hetzelfde dier gedurende meerdere dagen herhaaldelijk kan worden afgebeeld, waardoor de voortgang van individuele infectie in de loop van de tijd kan worden gevolgd. Deze functie zal waarschijnlijk een sleutelrol spelen in toekomstige studies naar de gastheer-pathogeen interactie.
Samenvattend resulteert dit protocol in beelden met een hoge ruimtelijke resolutie van C. albicans die groeien in het weefsel van een levende zoogdiergastheer, waardoor een nauwkeurige evaluatie van morfogenese in mutante stammen mogelijk is 8,9,10. De hier gepresenteerde resultaten laten zien hoe dit protocol kan worden gebruikt om een bibliotheek van C. albicans-mutanten te screenen. Van de tot nu toe geteste C. albicans-mutanten ondergaat een groot deel van de mutanten met bekende defecten in morfogenese in vitro gemakkelijk filamentatie in vivo 9,10. Dit benadrukt het belang van het opnemen van een in vivo systeem zoals dit in experimenten die zijn ontworpen om de mechanismen van C. albicans pathogenese op te helderen.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidie 1R01AI33409 en de afdeling Kindergeneeskunde, Carver College of Medicine, University of Iowa.
#1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
Isoflurane | Akorn | J119005 | |
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |