Het bepalen van de thermodynamische en kinetische associatie van een DNA-aptamer en tetracycline met behulp van isothermische titratiecalorimetrie
Summary
Het huidige protocol beschrijft het gebruik van isotherme titratiecalorimetrie (ITC) om de associatie en dissociatiekinetiek van de binding tussen een DNA-aptamer en tetracycline te analyseren, inclusief monstervoorbereiding, lopende normen en monsters, en het interpreteren van de resulterende gegevens.
Abstract
De bepaling van bindingsaffiniteit en gedrag tussen een aptamer en zijn doel is de meest cruciale stap bij het selecteren en gebruiken van een aptamer voor toepassing. Vanwege de drastische verschillen tussen het aptamer en kleine moleculen, moeten wetenschappers veel moeite doen om hun bindende eigenschappen te karakteriseren. Isothermische titratiecalorimetrie (ITC) is hiervoor een krachtige aanpak. ITC gaat verder dan het bepalen van disassociatieconstanten (Kd) en kan de enthalpieveranderingen en bindende stoichiometrie van de interactie tussen twee moleculen in de oplossingsfase leveren. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd, zodat het proces de binding tussen macromoleculen en hun kleine doelen gevoelig kan meten. Hierin introduceert het artikel een stapsgewijze procedure van de ITC-meting van een geselecteerde aptamer met een klein doelwit, tetracycline. Dit voorbeeld bewijst de veelzijdigheid van de techniek en het potentieel ervan voor andere toepassingen.
Introduction
Aptameren zijn ssDNA- of RNA-fragmenten geselecteerd via een evolutieproces met een hoge bindingsaffiniteit en specificiteit voor de gewenste doelen 1,2, die kunnen werken als geavanceerde herkenningselementen of chemische antilichamen 3,4,5. De bindingsaffiniteit en specificiteit van aptameren aan hun doelen spelen dus een cruciale rol bij de selectie en toepassing van een aptamer, en isotherme titratiecalorimetrie (ITC) is op grote schaal gebruikt voor deze karakteriseringsdoeleinden. Veel benaderingen zijn gebruikt om de affiniteit van aptameren te bepalen, waaronder ITC, oppervlakteplasmonresonantie (SPR), colorimetrische titratie, thermoforese op microschaal (MST) en Bio-Layer Interferometry (BLI). Onder hen is ITC een van de nieuwste technieken om de thermodynamische en kinetische associatie van twee moleculen in de oplossingsfase te bepalen. Deze benadering voert continue titratie uit met behulp van labelvrije moleculen en registreert de vrijgekomen warmte in de loop van de tijd bij de bindingsgebeurtenissen die door elke titratie worden geproduceerd 6,7. In tegenstelling tot andere methoden kan ITC bindingsaffiniteit, verschillende bindingsplaatsen en thermodynamische en kinetische associatie bieden (figuur 1A). Op basis van deze initiële parameters worden de Gibbs vrije energieveranderingen en entropieveranderingen bepaald met behulp van de volgende relatie:
ΔG = ΔH-TΔS
Dat betekent dat ITC een compleet thermodynamisch profiel van de moleculaire interactie biedt om de bindingsmechanismen op te helderen (figuur 1B). Het bepalen van de bindingsaffiniteit voor kleine moleculen met een aptamer is moeilijk vanwege de drastisch verschillende groottes tussen aptamer en target. Ondertussen kan ITC gevoelige metingen uitvoeren zonder moleculen te labelen en te immobiliseren, wat een middel biedt om de natuurlijke structuur van het aptamer en het doel tijdens de meting te behouden. Met de genoemde attributen kan ITC worden gebruikt als de standaardmethode voor de karakterisering van binding tussen een aptamer en kleine doelen.
Na selectie door de Gu-groep werd deze aptamer geïntegreerd met verschillende platforms, waaronder elektrochemische op aptamer gebaseerde biosensoren, een competitieve enzymgebonden aptamer-assay en een microtiterplaat, die detectie met hoge doorvoer van tetracycline 8,9,10 kan bereiken. De bindingseigenschappen zijn echter niet goed genoeg opgehelderd om het juiste platform te kiezen8; het is de moeite waard om de binding van het aptamer aan het tetracycline te karakteriseren met behulp van ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde methode is aangepast volgens de instructies van TA Instruments en is voldoende om de bindingsaffiniteit en thermodynamica van veel geselecteerde aptameren en doelen in ons centrum te bepalen. Cruciale stappen uit deze procedure zijn onder meer het uitwisselen van de buffer om een doel te hebben dat overeenkomt met het ligand, het uitvoeren van monsters met de juiste parameters en het vinden van het juiste bindingsmodel om de gegevens te analyseren. Continue registratie van warmteafgifte vereist het…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door de Research and Development Funding van Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2′,5′ RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
