Détermination de l’association thermodynamique et cinétique d’un aptamère d’ADN et d’une tétracycline à l’aide de la calorimétrie de titrage isotherme
Summary
Le présent protocole décrit l’utilisation de la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) pour analyser l’association et la cinétique de dissociation de la liaison entre un aptamère d’ADN et la tétracycline, y compris la préparation des échantillons, les étalons et les échantillons, et l’interprétation des données résultantes.
Abstract
La détermination de l’affinité et du comportement de liaison entre un aptamère et sa cible est l’étape la plus cruciale dans la sélection et l’utilisation d’un aptamère pour l’application. En raison des différences drastiques entre l’aptamère et les petites molécules, les scientifiques doivent faire beaucoup d’efforts pour caractériser leurs propriétés de liaison. La calorimétrie de titrage isotherme (ITC) est une approche puissante à cette fin. L’ITC va au-delà de la détermination des constantes de dissociation (K d) et peut fournir les changements d’enthalpie et la stœchiométrie de liaison de l’interaction entre deux molécules dans la phasede solution. Cette approche effectue un titrage continu à l’aide de molécules sans marquage et enregistre la chaleur libérée au fil du temps sur les événements de liaison produits par chaque titrage, de sorte que le processus peut mesurer avec sensibilité la liaison entre les macromolécules et leurs petites cibles. Ici, l’article présente une procédure étape par étape de la mesure ITC d’un aptamère sélectionné avec une petite cible, la tétracycline. Cet exemple prouve la polyvalence de la technique et son potentiel pour d’autres applications.
Introduction
Les aptamères sont des fragments d’ADNss ou d’ARN sélectionnés par un processus d’évolution avec une affinité et une spécificité de liaison élevées aux cibles souhaitées1,2, qui peuvent fonctionner comme des éléments de reconnaissance avancés ou des anticorps chimiques 3,4,5. Ainsi, l’affinité et la spécificité de liaison des aptamères à leurs cibles jouent un rôle crucial dans la sélection et l’application d’un aptamère, et la calorimétrie de titrage isotherme (ITC) a été largement utilisée à ces fins de caractérisation. De nombreuses approches ont été utilisées pour déterminer l’affinité des aptamères, notamment l’ITC, la résonance plasmonique de surface (SPR), le titrage colorimétrique, la thermophorèse à micro-échelle (MST) et l’interférométrie de la couche biologique (BLI). Parmi elles, l’ITC est l’une des dernières techniques permettant de déterminer l’association thermodynamique et cinétique de deux molécules en phase de solution. Cette approche effectue un titrage continu à l’aide de molécules sans marquage et enregistre la chaleur libérée au fil du temps lors des événements de liaison produits par chaque titrage 6,7. Contrairement à d’autres méthodes, l’ITC peut offrir une affinité de liaison, plusieurs sites de liaison et une association thermodynamique et cinétique (Figure 1A). À partir de ces paramètres initiaux, les changements d’énergie libre de Gibbs et les changements d’entropie sont déterminés à l’aide de la relation suivante:
ΔG = ΔH-TΔS
Cela signifie que l’ITC offre un profil thermodynamique complet de l’interaction moléculaire pour élucider les mécanismes de liaison (Figure 1B). Il est difficile de déterminer l’affinité de liaison pour les petites molécules avec un aptamère en raison des tailles radicalement différentes entre l’aptamère et la cible. Pendant ce temps, ITC peut fournir des mesures sensibles sans marquage ni immobilisation des molécules, ce qui permet de conserver la structure naturelle de l’aptamère et de la cible pendant la mesure. Avec les attributs mentionnés, ITC peut être utilisé comme méthode standard pour la caractérisation de la liaison entre un aptamère et de petites cibles.
Après sélection par le groupe Gu, cet aptamère a été intégré à différentes plates-formes, y compris des biocapteurs électrochimiques à base d’aptamères, un test compétitif d’aptamère lié à une enzyme et une plaque de microtitrage, qui peut permettre une détection à haut débit de la tétracycline 8,9,10. Cependant, ses caractéristiques de liaison n’ont pas été suffisamment bien élucidées pour choisir la plate-forme appropriée8; il convient de caractériser la liaison de l’aptamère à la tétracycline à l’aide de l’ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
La méthode présentée ici a été modifiée selon les instructions de TA Instruments et est suffisante pour déterminer l’affinité de liaison et la thermodynamique de nombreux aptamères et cibles sélectionnés dans notre centre. Les étapes cruciales de cette procédure comprennent l’échange du tampon pour avoir une cible correspondant au ligand, l’exécution d’échantillons avec les paramètres appropriés et la recherche du modèle d’ajustement de liaison approprié pour analyser les données. L’enreg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été soutenue par le financement de la recherche et du développement d’Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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