קביעת הקשר התרמודינמי והקינטי של אפטמר DNA וטטרציקלין באמצעות קלורימטריה איזותרמית טיטרציה
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השימוש בקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) כדי לנתח את קינטיקה של הקשר והדיסוציאציה של הקשירה בין אפטמר DNA לטטרציקלין, כולל הכנת דגימות, הפעלת תקנים ודגימות, ופענוח הנתונים המתקבלים.
Abstract
קביעת זיקה והתנהגות מחייבת בין אפטמר לבין מטרתו היא השלב המכריע ביותר בבחירת אפטמר ליישום ובשימוש בו. בשל ההבדלים הדרסטיים בין האפטמר למולקולות קטנות, מדענים צריכים להשקיע מאמץ רב באפיון תכונות הקשירה שלהן. קלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) היא גישה רבת עוצמה למטרה זו. ITC חורג מקביעת קבועי ההתנתקות (Kd) ויכול לספק את השינויים האנתלפיים ואת הסטויכיומטריה המחייבת של האינטראקציה בין שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה, כך שהתהליך יכול למדוד ברגישות את הקשירה בין מקרומולקולות לבין המטרות הקטנות שלהן. כאן, המאמר מציג הליך שלב אחר שלב של מדידת ITC של אפטמר נבחר עם מטרה קטנה, טטרציקלין. דוגמה זו מוכיחה את הרבגוניות של הטכניקה ואת הפוטנציאל שלה ליישומים אחרים.
Introduction
Aptamers הם מקטעי ssDNA או RNA שנבחרו בתהליך אבולוציה עם זיקה וספציפיות גבוהה ליעדים הרצויים 1,2, שיכולים לעבוד כיסודות זיהוי מתקדמים או נוגדנים כימיים 3,4,5. לפיכך, זיקתם וספציפיותם של האפטמרים למטרותיהם ממלאות תפקיד מכריע בבחירה וביישום של אפטאמר, וקלורימטריה איזותרמית של טיטרציה (ITC) נמצאת בשימוש נרחב למטרות אפיון אלה. גישות רבות שימשו לקביעת הזיקה של אפטמרים, כולל ITC, תהודת פלסמון פני השטח (SPR), טיטרציה צבעונית, תרמופורזה בקנה מידה זעיר (MST) ואינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI). ביניהם, ITC היא אחת הטכניקות האחרונות כדי לקבוע את הקשר התרמודינמי והקינטי של שתי מולקולות בשלב התמיסה. גישה זו מבצעת טיטרציה רציפה באמצעות מולקולות נטולות תוויות ומתעדת חום המשתחרר לאורך זמן על אירועי הקשירה המיוצרים על ידי כל טיטרציה 6,7. בניגוד לשיטות אחרות, ITC יכול להציע זיקה מחייבת, מספר אתרי קשירה וקשר תרמודינמי וקינטי (איור 1A). מפרמטרים ראשוניים אלה, השינויים באנרגיה החופשית של גיבס ושינויי האנטרופיה נקבעים באמצעות הקשר הבא:
ΔG = ΔH-TΔS
משמעות הדבר היא ש-ITC מציע פרופיל תרמודינמי מלא של האינטראקציה המולקולרית כדי להבהיר את מנגנוני הקשירה (איור 1B). קביעת זיקת הקשירה למולקולות קטנות עם אפטמר קשה בשל הגדלים השונים באופן דרסטי בין אפטמר למטרה. בינתיים, ITC יכול לספק מדידה רגישה ללא תיוג ושיתוק מולקולות, מה שמספק אמצעי לשמירה על המבנה הטבעי של האפטמר והמטרה במהלך המדידה. עם התכונות שהוזכרו, ITC יכול לשמש כשיטה סטנדרטית לאפיון קשירה בין aptamer לבין מטרות קטנות.
לאחר בחירה על ידי קבוצת Gu, אפטמר זה שולב עם פלטפורמות שונות, כולל ביוסנסורים מבוססי אפטמר אלקטרוכימיים, בדיקת אפטמר תחרותית הקשורה לאנזים, וצלחת מיקרוטיטר, שיכולה להשיג זיהוי תפוקה גבוהה של טטרציקלין 8,9,10. עם זאת, המאפיינים המחייבים שלה לא הובהרו מספיק טוב כדי לבחור את הפלטפורמה הנכונה8; כדאי לאפיין את הכריכה של aptamer לטטרציקלין באמצעות ITC.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המוצגת כאן שונתה בהתאם להוראת ת”א מכשירים והיא מספיקה כדי לקבוע את זיקת הקשירה והתרמודינמיקה של אפטאמרים ומטרות נבחרות רבות במרכזנו. שלבים מכריעים מהליך זה כוללים החלפת המאגר כך שיהיה לו יעד התואם את הליגנד, הרצת דגימות עם פרמטרים מתאימים ומציאת מודל התאמת המחייב המתאים לניתוח הנתו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מימון המחקר והפיתוח של Aptagen LLC.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
References
- Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
- Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249 (4968), 505-510 (1990).
- Kim, S. H., Thoa, T. T. T., Gu, M. B. Aptasensors for environmental monitoring of contaminants in water and soil. Current Opinion in Environmental Science & Health. 10, 9-21 (2019).
- Dunn, M. R., Jimenez, R. M., Chaput, J. C. Analysis of aptamer discovery and technology. Nature Reviews Chemistry. 1, 0076 (2017).
- Stoltenburg, R., Reinemann, C., Strehlitz, B. SELEX–A (r)evolutionary method to generate high-affinity nucleic acid ligands. Biomolecular Engineering. 24 (4), 381-403 (2007).
- Wang, Y., Wang, G., Moitessier, N., Mittermaier, A. K. Enzyme kinetics by isothermal titration calorimetry: Allostery, inhibition, and dynamics. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 583826 (2020).
- Velazquez-Campoy, A., Freire, E. Isothermal titration calorimetry to determine association constants for high-affinity ligands. Nature Protocols. 1 (1), 186-191 (2006).
- Niazi, J. H., Lee, S. J., Gu, M. B. Single-stranded DNA aptamers specific for antibiotics tetracyclines. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 16 (15), 7245-7253 (2008).
- Kim, Y. J., Kim, Y. S., Niazi, J. H., Gu, M. B. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection. Bioprocess and Biosystems Engineering. 33 (1), 31-37 (2010).
- Wang, S., et al. Development of an indirect competitive assay-based aptasensor for highly sensitive detection of tetracycline residue in honey. Biosensors & Bioelectronics. 57, 192-198 (2014).
- Kim, Y. S., et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline. Biosensors & Bioelectronics. 26 (4), 1644-1649 (2010).
- Thoa, T. T., Minagawa, N., Aigaki, T., Ito, Y., Uzawa, T. Regulation of photosensitisation processes by an RNA aptamer. Scientific Reports. 7, 43272 (2017).
- Horowitz, E. D., Lilavivat, S., Holladay, B. W., Germann, M. W., Hud, N. V. Solution structure and thermodynamics of 2′,5′ RNA intercalation. Journal of the American Chemical Society. 131 (16), 5831-5838 (2009).
- Sigurskjold, B. W. Exact analysis of competition ligand binding by displacement isothermal titration calorimetry. Analytical Biochemistry. 277 (2), 260-266 (2000).
- Neves, M. A. D., Slavkovic, S., Churcher, Z. R., Johnson, P. E. Salt-mediated two-site ligand binding by the cocaine-binding aptamer. Nucleic Acids Research. 45 (3), 1041-1048 (2017).
- Turnbull, W. B., Daranas, A. H. On the value of c: Can low affinity systems be studied by isothermal titration calorimetry. Journal of the American Chemical Society. 125 (48), 14859-14866 (2003).
- Van Ness, J., Van Ness, L. K., Galas, D. J. Isothermal reactions for the amplification of oligonucleotides. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (8), 4504-4509 (2003).
