Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins mittels isothermer Titrationskalorimetrie
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Verwendung der isothermen Titrationskalorimetrie (ITC) zur Analyse der Assoziation und Dissoziationskinetik der Bindung zwischen einem DNA-Aptamer und Tetracyclin, einschließlich Probenvorbereitung, Ausführung von Standards und Proben und Interpretation der resultierenden Daten.
Abstract
Die Bestimmung der Bindungsaffinität und des Bindungsverhaltens zwischen einem Aptamer und seinem Ziel ist der wichtigste Schritt bei der Auswahl und Verwendung eines Aptamers für die Anwendung. Aufgrund der drastischen Unterschiede zwischen dem Aptamer und kleinen Molekülen müssen Wissenschaftler viel Aufwand betreiben, um ihre Bindungseigenschaften zu charakterisieren. Die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein leistungsfähiger Ansatz für diesen Zweck. ITC geht über die Bestimmung von Dissoziationskonstanten (Kd) hinaus und kann die Enthalpieänderungen und die Bindungsstöchiometrie der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen in der Lösungsphase liefern. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration mit markierungsfreien Molekülen durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den Bindungsereignissen auf, die bei jeder Titration erzeugt werden, so dass der Prozess die Bindung zwischen Makromolekülen und ihren kleinen Zielen empfindlich messen kann. Hier stellt der Artikel ein schrittweises Verfahren der ITC-Messung eines ausgewählten Aptamers mit einem kleinen Ziel, Tetracyclin, vor. Dieses Beispiel beweist die Vielseitigkeit der Technik und ihr Potenzial für andere Anwendungen.
Introduction
Aptamere sind ssDNA- oder RNA-Fragmente, die durch einen Evolutionsprozess mit hoher Bindungsaffinität und Spezifität zu den gewünschten Zielen 1,2 selektiert werden, die als fortgeschrittene Erkennungselemente oder chemische Antikörper 3,4,5 wirken können. Daher spielen die Bindungsaffinität und Spezifität von Aptameren an ihre Ziele eine entscheidende Rolle bei der Auswahl und Anwendung eines Aptamers, und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC) wurde für diese Charakterisierungszwecke häufig verwendet. Viele Ansätze wurden verwendet, um die Affinität von Aptameren zu bestimmen, einschließlich ITC, Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), kolorimetrische Titration, mikroskalige Thermophorese (MST) und Bio-Schichtinterferometrie (BLI). Unter ihnen ist ITC eine der neuesten Techniken, um die thermodynamische und kinetische Assoziation von zwei Molekülen in der Lösungsphase zu bestimmen. Dieser Ansatz führt eine kontinuierliche Titration unter Verwendung markierungsfreier Moleküle durch und zeichnet die im Laufe der Zeit freigesetzte Wärme bei den bei jeder Titration erzeugten Bindungsereignissen auf 6,7. Im Gegensatz zu anderen Methoden kann ITC Bindungsaffinität, mehrere Bindungsstellen sowie thermodynamische und kinetische Assoziationen bieten (Abbildung 1A). Aus diesen Anfangsparametern werden die Gibbs-Änderungen der freien Energie und die Entropieänderungen unter Verwendung der folgenden Beziehung bestimmt:
ΔG = ΔH-TΔS
Das bedeutet, dass ITC ein vollständiges thermodynamisches Profil der molekularen Wechselwirkung bietet, um die Bindungsmechanismen aufzuklären (Abbildung 1B). Die Bestimmung der Bindungsaffinität für kleine Moleküle mit einem Aptamer ist aufgrund der drastisch unterschiedlichen Größen zwischen Aptamer und Target schwierig. In der Zwischenzeit kann ITC empfindliche Messungen ohne Markierung und Immobilisierung von Molekülen durchführen, was ein Mittel bietet, die natürliche Struktur des Aptamers und des Ziels während der Messung beizubehalten. Mit den genannten Attributen kann ITC als Standardmethode zur Charakterisierung der Bindung zwischen einem Aptamer und kleinen Targets verwendet werden.
Nach der Auswahl durch die Gu-Gruppe wurde dieses Aptamer in verschiedene Plattformen integriert, darunter elektrochemische Aptamer-basierte Biosensoren, ein kompetitiver enzymgebundener Aptamer-Assay und eine Mikrotiterplatte, die einen Hochdurchsatznachweis von Tetracyclin 8,9,10 erreichen kann. Seine Bindungseigenschaften sind jedoch nicht gut genug aufgeklärt, um die richtige Plattform8 zu wählen; Es lohnt sich, die Bindung des Aptamers an das Tetracyclin mittels ITC zu charakterisieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier vorgestellte Methode wurde gemäß den Anweisungen von TA Instruments modifiziert und reicht aus, um die Bindungsaffinität und Thermodynamik vieler ausgewählter Aptamere und Targets in unserem Zentrum zu bestimmen. Zu den entscheidenden Schritten dieses Verfahrens gehören der Austausch des Puffers, um ein Ziel zu haben, das dem Liganden entspricht, das Ausführen von Proben mit geeigneten Parametern und das Finden des geeigneten Bindungsanpassungsmodells zur Analyse der Daten. Die kontinuierliche Aufzeichnung…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde durch die Forschungs- und Entwicklungsfinanzierung von Aptagen LLC unterstützt.
Materials
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGCG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3' |
Integrated DNA Technologies, Inc | The sequence is adopted from Gu's research, which has not identified Kd using ITC (refer references 8 and 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µL) System Complete–Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Isothermal titration calorimetry system |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Calcium chloride 1 M in aqueous solution, Biotechnology Grade, sterile |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | The Eppendorf 5417R is unsurpassed in safety, reliability and ease-of-use. Very easy to maintain with a brushless motor that spins up to 16,400 RPM with maximum RCF up to 25,000 x g. |
| Complete Degassing Station (110/230V) | TA Instruments | 6326 | This degasser provides a self-contained stirring platform, vacuum chamber, vacuum port, temperature control and electronic timer for proper sample preparation. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-ONE-W | UV-Vis Spectrophotometer |
| Nanosep, Nanosep MF and NAB Centrifugal Devices | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa molecular weight cutoff concentrator |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific | IB70165 | Buffer containing Sodium phosphate, Sodium chloride, Potassium phosphate, and Potassium chloride Ultra-Pure Grade Sterile filtered using 0.2 µm filter. Autoclaved at 121 °C for greater than 20 min. |
| Posi-Click 1.7 mL Large Cap Microcentrifuge Tubes | labForce (a Thomas Scientific Brand) | 1149K01 | |
| Tetracycline, Hydrochoride | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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