Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie
Summary
Met behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo’s te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.
Abstract
Fragiele X mentale retardatie-eiwit (FMRP) is een mRNA-bindend eiwit dat de lokale eiwittransformatie reguleert. FMRP-verlies of disfunctie leidt tot afwijkende neuronale en synaptische activiteiten bij fragiele X-syndroom (FXS), dat wordt gekenmerkt door intellectuele achterstand, sensorische afwijkingen en sociale communicatieproblemen. Studies naar FMRP-functie en FXS-pathogenese zijn voornamelijk uitgevoerd met Fmr1 (het gen dat codeert voor FMRP) knock-out bij transgene dieren. Hier rapporteren we een in vivo methode voor het bepalen van de cel-autonome functie van FMRP tijdens de periode van circuitassemblage en synaptische vorming met behulp van kippenembryo’s. Deze methode maakt gebruik van fase-, plaats- en richtingsspecifieke elektroporatie van een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem met Fmr1 klein haarspeld-RNA (shRNA) en een EGFP-verslaggever. Met deze methode bereikten we selectieve FMRP-knockdown in het auditieve ganglion (AG) en in een van zijn hersenstamdoelen, de nucleus magnocellularis (NM), waardoor een componentspecifieke manipulatie binnen het AG-NM-circuit werd geboden. Bovendien maakt het mozaïekpatroon van de transfectie controles binnen het dier en naburige neuron / vezelvergelijkingen mogelijk voor verbeterde betrouwbaarheid en gevoeligheid bij het analyseren van gegevens. Het induceerbare vectorsysteem biedt temporele controle over het begin van genbewerking om accumulerende ontwikkelingseffecten te minimaliseren. De combinatie van deze strategieën biedt een innovatief hulpmiddel om de cel-autonome functie van FMRP in synaptische en circuitontwikkeling te ontleden.
Introduction
Fragiele X-syndroom (FXS) is een neurologische ontwikkelingsstoornis die wordt gekenmerkt door een verstandelijke beperking, sensorische afwijkingen en autistisch gedrag. In de meeste gevallen wordt FXS veroorzaakt door een wereldwijd verlies van fragiel X-mentaal retardatie-eiwit (FMRP; gecodeerd door het Fmr1-gen) vanaf vroege embryonale stadia1. FMRP is een RNA-bindend eiwit dat normaal tot expressie komt in de meeste neuronen en gliacellen in de hersenen, evenals in sensorische organen 2,3,4. In zoogdierhersenen wordt FMRP waarschijnlijk geassocieerd met honderden mRNA’s die coderen voor eiwitten die belangrijk zijn voor verschillende neurale activiteiten5. Studies van conventionele Fmr1 knock-out dieren toonden aan dat FMRP-expressie bijzonder belangrijk is voor de assemblage en plasticiteit van synaptische neurotransmissie6. Verschillende voorwaardelijke en mozaïek knock-outmodellen hebben verder aangetoond dat FMRP-acties en -signalen variëren tussen hersengebieden, celtypen en synaptische locaties tijdens verschillende ontwikkelingsgebeurtenissen, waaronder axonale projectie, dendritische patronen en synaptische plasticiteit 7,8,9,10,11,12,13,14 . Acute functie van FMRP bij het reguleren van synaptische transmissie werd bestudeerd door intracellulaire toediening van remmende FMRP-antilichamen of FMRP zelf in hersenplakken of gekweekte neuronen 15,16,17,18. Deze methoden bieden echter niet de mogelijkheid om FMRP-misexpressie-geïnduceerde gevolgen tijdens de ontwikkeling te volgen. Het ontwikkelen van in vivo methoden om de cel-autonome functies van FMRP te onderzoeken is dus in grote behoefte, en naar verwachting zal het helpen bepalen of de gerapporteerde anomalieën bij FXS-patiënten directe gevolgen zijn van FMRP-verlies in de geassocieerde neuronen en circuits, of secundaire gevolgen afgeleid van netwerkbrede veranderingen tijdens ontwikkeling19.
De auditieve hersenstam van kippenembryo’s biedt een uniek voordelig model voor diepgaande functionele analyses van FMRP-regulatie in circuit- en synapsontwikkeling. De gemakkelijke toegang tot embryonale kippenhersenen en de gevestigde ovo-elektroporatietechniek voor genetische manipulatie hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van de ontwikkeling van de hersenen in vroege embryonale stadia. In een onlangs gepubliceerde studie werd deze techniek gecombineerd met geavanceerde moleculaire hulpmiddelen die temporele controle van FMRP-misexpressie20,21 mogelijk maken. Hier is de methodologie geavanceerd om selectieve manipulaties van presynaptische en postsynaptische neuronen afzonderlijk te induceren. Deze methode is ontwikkeld in het auditieve hersenstamcircuit. Akoestisch signaal wordt gedetecteerd door haarcellen in het auditieve binnenoor en vervolgens overgebracht naar het auditieve ganglion (AG; ook wel het spiraalganglion bij zoogdieren genoemd). Bipolaire neuronen in de AG innerveren haarcellen met hun perifere processen en sturen op hun beurt een centrale projectie (de gehoorzenuw) naar de hersenstam waar ze eindigen in twee primaire cochleaire kernen, de nucleus magnocellularis (NM) en de nucleus angularis (NA). Neuronen in de NM zijn structureel en functioneel vergelijkbaar met de bolvormige bossige cellen van de anteroventrale cochleaire kern van zoogdieren. Binnen de NM synapsen gehoorzenuwvezels (ANF’s) op de somata van NM-neuronen via de grote eindbulb van Held terminals22. Tijdens de ontwikkeling ontstaan NM-neuronen uit rhombomeren 5 en 6 (r5/6) in de achterhersenen23, terwijl AG-neuronen zijn afgeleid van neuroblasten die zich in de otocyste24 bevinden. Hier beschrijven we de procedure om selectief FMRP-expressie in de presynaptische AG-neuronen en in de postsynaptische NM-neuronen afzonderlijk af te slaan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om de cel-autonome functie van FMRP te bepalen, is het manipuleren van de expressie ervan in individuele celgroepen of celtypen noodzakelijk. Aangezien een van de belangrijkste functies van FMRP is om synaptische vorming en plasticiteit te reguleren, is het selectief manipuleren van elke synaptische component van een bepaald circuit een voorwaarde voor een volledig begrip van het FMRP-mechanisme in synaptische communicatie. Met behulp van ovo-elektroporatie van kippenembryo’s de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door: een national natural science foundation of China grant (nr. 32000697); het wetenschaps- en technologieprogramma van Guangzhou (202102080139); de Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); de Fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de Centrale Universiteiten (11620324); een onderzoeksbeurs van Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministerie van Onderwijs, Jinan University (Nr. ZSYXM202107); de fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de centrale universiteiten van China (21621054); en de Medical Scientific Research Foundation van de provincie Guangdong in China (20191118142729581). We bedanken het medisch experimenteel centrum van Jinan University. Wij danken Dr. Terra Bradley voor de zorgvuldige bewerking van het manuscript.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
- Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
- Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
- Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
- Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
- Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
- Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
- Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
- Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
- Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
- Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
- Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
- Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
- Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
- Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).
