ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo
Summary
תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.
Abstract
חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP) הוא חלבון קושר mRNA המווסת את תרגום החלבון המקומי. אובדן FMRP או תפקוד לקוי מוביל לפעילות עצבית וסינפטית חריגה בתסמונת X שביר (FXS), המאופיינת במוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות ובעיות תקשורת חברתית. מחקרים על תפקוד FMRP ופתוגנזה של FXS נערכו בעיקר עם Fmr1 (הנוקאאוט של FMRP המקודד גנים בבעלי חיים מהונדסים. כאן אנו מדווחים על שיטת in vivo לקביעת התפקוד האוטונומי של FMRP במהלך תקופת הרכבת המעגלים והיווצרות סינפטית באמצעות עוברי עוף. שיטה זו משתמשת באלקטרופורציה ספציפית לשלב, לאתר ולכיוון של מערכת וקטורית הניתנת להשראה לתרופות המכילה Fmr1 RNA קטן של סיכות שיער (shRNA) וכתב EGFP. בשיטה זו, השגנו נוק-דאון סלקטיבי של FMRP בגנגליון השמיעתי (AG) ובאחת ממטרות גזע המוח שלו, הגרעין מגנוצלולריס (NM), ובכך סיפקנו מניפולציה ספציפית לרכיב בתוך מעגל AG-NM. בנוסף, תבנית הפסיפס של ההעברה מאפשרת בקרות בתוך בעלי חיים והשוואות נוירונים/סיבים שכנים לאמינות ורגישות משופרות בניתוח נתונים. מערכת הווקטורים האינדוקטיביים מספקת בקרה זמנית על הופעת עריכת גנים כדי למזער את ההשפעות ההתפתחותיות המצטברות. השילוב של אסטרטגיות אלה מספק כלי חדשני לנתח את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP בפיתוח סינפטי ומעגלים.
Introduction
תסמונת X שביר (FXS) היא הפרעה נוירו-התפתחותית המאופיינת על ידי מוגבלות אינטלקטואלית, הפרעות חושיות והתנהגויות אוטיסטיות. ברוב המקרים, FXS נגרמת על ידי אובדן גלובלי של חלבון פיגור שכלי X שביר (FMRP; מקודד על ידי הגן Fmr1) החל משלבים עובריים מוקדמים1. FMRP הוא חלבון קושר RNA המתבטא בדרך כלל ברוב תאי העצב ותאי הגליה במוח, כמו גם באיברי החישה 2,3,4. במוחות של יונקים, FMRP קשור ככל הנראה למאות mRNA המקודדים חלבונים החשובים לפעילויות עצביות שונות5. מחקרים על חיות נוקאאוט Fmr1 קונבנציונליות הראו כי ביטוי FMRP חשוב במיוחד להרכבה ולפלסטיות של העברה עצבית סינפטית6. מספר מודלים של נוקאאוט מותנה ופסיפס הראו עוד כי פעולות ואותות FMRP משתנים בין אזורי מוח, סוגי תאים ואתרים סינפטיים במהלך מספר אירועים התפתחותיים, כולל הקרנה אקסונלית, דפוס דנדריטי ופלסטיות סינפטית 7,8,9,10,11,12,13,14 . תפקוד חריף של FMRP בוויסות ההעברה הסינפטית נחקר על ידי העברה תוך תאית של נוגדני FMRP מעכבים או FMRP עצמו בפרוסות מוח או נוירונים בתרבית15,16,17,18. עם זאת, שיטות אלה אינן מציעות את היכולת לעקוב אחר ההשלכות הנגרמות על ידי ביטוי שגוי של FMRP במהלך הפיתוח. לפיכך, פיתוח שיטות in vivo כדי לחקור את הפונקציות התאיות-אוטונומיות של FMRP הוא נחוץ מאוד, וצפוי לעזור לקבוע אם האנומליות המדווחות בחולי FXS הן השלכות ישירות של אובדן FMRP בנוירונים ובמעגלים הקשורים, או השלכות משניות הנגזרות משינויים ברחבי הרשת במהלך הפיתוח19.
גזע המוח השמיעתי של עוברי עוף מציע מודל בעל יתרון ייחודי לניתוחים תפקודיים מעמיקים של ויסות FMRP בהתפתחות מעגלים וסינפסות. הגישה הקלה למוחות של תרנגולות עובריות והטכניקה המבוססת היטב של אלקטרופורציה של אובו למניפולציה גנטית תרמו רבות להבנתנו את התפתחות המוח בשלבים עובריים מוקדמים. במחקר שפורסם לאחרונה, טכניקה זו שולבה עם כלים מולקולריים מתקדמים המאפשרים שליטה זמנית של ביטוי שגוי של FMRP20,21. כאן, המתודולוגיה מתקדמת כדי לגרום למניפולציות סלקטיביות של נוירונים קדם-סינפטיים ופוסט-סינפטיים בנפרד. שיטה זו פותחה במעגל גזע המוח השמיעתי. אות אקוסטי מזוהה על ידי תאי שערה באוזן הפנימית השמיעתית ולאחר מכן מועבר לגנגליון השמיעתי (AG; נקרא גם גנגליון ספירלי ביונקים). נוירונים דו-קוטביים ב-AG innervates את תאי השערה עם התהליכים ההיקפיים שלהם, ובתורם שולחים הקרנה מרכזית (עצב השמיעה) לגזע המוח, שם הם מסתיימים בשני גרעיני שבלול עיקריים, הגרעין מגנוצלולריס (NM) והגרעין הזוויתי (NA). תאי עצב ב-NM דומים מבחינה מבנית ותפקודית לתאי השיח הכדוריים של גרעין השבלול האנטרו-בנטרלי של היונקים. בתוך ה-NM, סיבי עצב השמיעה (ANFs) סינפסה על הסומטה של נוירוני NM דרך הקצה הגדול של הדקים22. במהלך ההתפתחות, נוירונים NM נובעים מרומבומרים 5 ו -6 (r5/6) במוח האחורי23, בעוד נוירונים AG נגזרים נוירובלסטים השוכנים באוטוציסט24. כאן אנו מתארים את הפרוצדורה לדיכוי סלקטיבי של ביטוי FMRP בנוירוני AG הקדם-סינפטיים ובנוירוני NM הפוסט-סינפטיים בנפרד.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לקבוע את הפונקציה התאית-אוטונומית של FMRP, יש צורך במניפולציה של הביטוי שלה בקבוצות תאים בודדות או בסוגי תאים. מכיוון שאחד התפקידים העיקריים של FMRP הוא לווסת את ההיווצרות והפלסטיות הסינפטית, מניפולציה סלקטיבית של כל רכיב סינפטי של מעגל מסוים היא תנאי מוקדם להבנה מלאה של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי: מענק של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס ‘32000697); תוכנית המדע והטכנולוגיה של גואנגג’ואו (202102080139); קרן גואנגדונג למדעי הטבע (2019A1515110625, 2021A1515010619); קרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (11620324); מענק מחקר של מעבדת מפתח לרפואה רגנרטיבית, משרד החינוך, אוניברסיטת ג’ינאן (לא. ZSYXM202107); קרנות המחקר הבסיסיות של האוניברסיטאות המרכזיות של סין (21621054); וקרן המחקר המדעי הרפואי של מחוז גואנגדונג בסין (20191118142729581). אנו מודים למרכז הניסויים הרפואי של אוניברסיטת ג’ינאן. אנו מודים לד”ר טרה בראדלי על העריכה הקפדנית של כתב היד.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
- Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
- Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
- Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
- Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
- Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
- Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
- Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
- Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
- Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
- Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
- Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
- Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
- Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
- Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).
