Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

La sindrome dell’X fragile (FXS) è un disturbo dello sviluppo neurologico caratterizzato da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e comportamenti autistici. Nella maggior parte dei casi, la FXS è causata da una perdita globale della proteina di ritardo mentale dell’X fragile (FMRP; codificata dal gene Fmr1) a partire dalle prime fasi embrionali¹. FMRP è una proteina legante l’RNA che è normalmente espressa nella maggior parte dei neuroni e delle cellule gliali nel cervello, così come negli organi sensoriali ^2,3,4. Nel cervello dei mammiferi, FMRP è probabilmente associato a centinaia di mRNA che codificano proteine importanti per varie attività neurali⁵. Studi su animali knockout convenzionali Fmr1 hanno dimostrato che l’espressione di FMRP è particolarmente importante per l’assemblaggio e la plasticità della neurotrasmissione sinaptica⁶. Diversi modelli di knockout condizionale e a mosaico hanno ulteriormente dimostrato che le azioni e i segnali FMRP variano tra regioni del cervello, tipi di cellule e siti sinaptici durante diversi eventi di sviluppo tra cui proiezione assonale, pattern dendritico e plasticità sinaptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La funzione acuta di FMRP nella regolazione della trasmissione sinaptica è stata studiata mediante somministrazione intracellulare di anticorpi inibitori FMRP o FMRP stesso in fette di cervello o neuroni in coltura^15,16,17,18. Questi metodi, tuttavia, non offrono la possibilità di tracciare le conseguenze indotte da espressioni errate di FMRP durante lo sviluppo. Pertanto, lo sviluppo di metodi in vivo per studiare le funzioni autonome cellulari di FMRP è in grande bisogno e dovrebbe aiutare a determinare se le anomalie riportate nei pazienti con FXS sono conseguenze dirette della perdita di FMRP nei neuroni e nei circuiti associati o conseguenze secondarie derivate da cambiamenti a livello di rete durante lo sviluppo¹⁹.

Il tronco cerebrale uditivo degli embrioni di pollo offre un modello straordinariamente vantaggioso per analisi funzionali approfondite della regolazione FMRP nello sviluppo di circuiti e sinapsi. Il facile accesso ai cervelli embrionali di pollo e la ben consolidata tecnica di elettroporazione ovo per la manipolazione genetica hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione dello sviluppo del cervello nelle prime fasi embrionali. In uno studio pubblicato di recente, questa tecnica è stata combinata con strumenti molecolari avanzati che consentono il controllo temporale della misespressione di FMRP^20,21. Qui, la metodologia è avanzata per indurre manipolazioni selettive dei neuroni presinaptici e postsinaptici separatamente. Questo metodo è stato sviluppato nel circuito uditivo del tronco cerebrale. Il segnale acustico viene rilevato dalle cellule ciliate nell’orecchio interno uditivo e quindi trasmesso al ganglio uditivo (AG; chiamato anche ganglio a spirale nei mammiferi). I neuroni bipolari nell’AG innervano le cellule ciliate con i loro processi periferici e a loro volta inviano una proiezione centrale (il nervo uditivo) al tronco cerebrale dove terminano in due nuclei cocleari primari, il nucleo magnocellularis (NM) e il nucleo angolare (NA). I neuroni nella NM sono strutturalmente e funzionalmente paragonabili alle cellule cespugliose sferiche del nucleo cocleare anteroventrale dei mammiferi. All’interno della NM, sinapsi delle fibre nervose uditive (ANF) sulla somata dei neuroni NM attraverso il grande bulbo terminale dei terminali Held²². Durante lo sviluppo, i neuroni NM derivano dai rombomeri 5 e 6 (r5/6) nel cervello posteriore²³, mentre i neuroni AG derivano dai neuroblasti che risiedono nell’otocisti²⁴. Qui, descriviamo la procedura per abbattere selettivamente l’espressione di FMRP nei neuroni AG presinaptici e nei neuroni NM postsinaptici separatamente.