تشريح وظيفة الخلية المستقلة لبروتين التخلف العقلي X الهش في دائرة سمعية بواسطة التثقيب الكهربائي في Ovo
Summary
باستخدام التثقيب الكهربائي للبويضات ، ابتكرنا طريقة لنقل الأذن الداخلية السمعية ونواة القوقعة بشكل انتقائي في أجنة الدجاج لتحقيق ضربة قاضية خاصة بمجموعة الخلايا لبروتين التخلف العقلي X الهش خلال فترات منفصلة من تجميع الدائرة.
Abstract
بروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP) هو بروتين مرتبط بالحمض النووي الريبوزي المرسال ينظم ترجمة البروتين المحلي. يؤدي فقدان FMRP أو اختلاله الوظيفي إلى أنشطة عصبية ومشبكية شاذة في متلازمة X الهشة (FXS) ، والتي تتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية ومشاكل التواصل الاجتماعي. أجريت دراسات على وظيفة FMRP والتسبب في FXS في المقام الأول مع Fmr1 (الجين المشفر FMRP) بالضربة القاضية في الحيوانات المعدلة وراثيا. هنا نبلغ عن طريقة في الجسم الحي لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP خلال فترة تجميع الدائرة والتكوين المشبكي باستخدام أجنة الدجاج. تستخدم هذه الطريقة التثقيب الكهربائي الخاص بالمرحلة والموقع والاتجاه لنظام ناقل محفز للدواء يحتوي على الحمض النووي الريبي الصغير Fmr1 (shRNA) ومراسل EGFP. باستخدام هذه الطريقة ، حققنا ضربة قاضية انتقائية FMRP في العقدة السمعية (AG) وفي أحد أهداف جذع الدماغ ، النواة المغنطيسية (NM) ، وبالتالي توفير معالجة خاصة بالمكونات داخل دائرة AG-NM. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح نمط الفسيفساء للنقل بضوابط داخل الحيوان ومقارنات الخلايا العصبية / الألياف المجاورة لتعزيز الموثوقية والحساسية في تحليل البيانات. يوفر نظام الناقل المحرض تحكما زمنيا في بداية تحرير الجينات لتقليل التأثيرات التنموية المتراكمة. يوفر الجمع بين هذه الاستراتيجيات أداة مبتكرة لتشريح وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP في تطوير المشبكي والدوائر.
Introduction
متلازمة X الهشة (FXS) هي اضطراب في النمو العصبي يتميز بالإعاقة الذهنية والتشوهات الحسية وسلوكيات التوحد. في معظم الحالات ، يحدث FXS بسبب فقدان عالمي لبروتين التخلف العقلي X الهش (FMRP ؛ مشفر بواسطة جين Fmr1) بدءا من المراحل الجنينية المبكرة1. FMRP هو بروتين ملزم للحمض النووي الريبي يتم التعبير عنه عادة في معظم الخلايا العصبية والخلايا الدبقية في الدماغ ، وكذلك في الأعضاء الحسية2،3،4. في أدمغة الثدييات ، من المحتمل أن يرتبط FMRP بمئات من mRNAs التي تشفر البروتينات المهمة لمختلف الأنشطة العصبية5. أظهرت الدراسات التي أجريت على الضربة القاضية Fmr1 التقليدية أن تعبير FMRP مهم بشكل خاص لتجميع ومرونة النقل العصبي المشبكي6. أظهرت العديد من نماذج الضربة القاضية الشرطية والفسيفسائية كذلك أن إجراءات وإشارات FMRP تختلف عبر مناطق الدماغ وأنواع الخلايا والمواقع المشبكية خلال العديد من الأحداث التنموية بما في ذلك الإسقاط المحوري ، والزخرفة الشجيرية ، واللدونة المشبكية7،8،9،10،11،12،13،14 . تمت دراسة الوظيفة الحادة ل FMRP في تنظيم الانتقال المشبكي عن طريق التوصيل داخل الخلايا للأجسام المضادة FMRP المثبطة أو FMRP نفسها في شرائح الدماغ أو الخلايا العصبية المستزرعة15،16،17،18. ومع ذلك ، لا توفر هذه الأساليب القدرة على تتبع العواقب الناجمة عن سوء التعبير عن FMRP أثناء التطوير. وبالتالي ، فإن تطوير طرق في الجسم الحي للتحقيق في وظائف الخلايا المستقلة ل FMRP في حاجة ماسة ، ومن المتوقع أن يساعد في تحديد ما إذا كانت الحالات الشاذة المبلغ عنها في مرضى FXS هي عواقب مباشرة لفقدان FMRP في الخلايا العصبية والدوائر المرتبطة ، أو عواقب ثانوية مشتقة من التغييرات على مستوى الشبكة أثناء التطوير19.
يقدم جذع الدماغ السمعي لأجنة الدجاج نموذجا مفيدا بشكل فريد للتحليلات الوظيفية المتعمقة لتنظيم FMRP في تطور الدائرة والمشبك. ساهمت سهولة الوصول إلى أدمغة الدجاج الجنينية وتقنية التثقيب الكهربائي للبيض الراسخة للتلاعب الجيني بشكل كبير في فهمنا لنمو الدماغ في المراحل الجنينية المبكرة. في دراسة نشرت مؤخرا ، تم دمج هذه التقنية مع الأدوات الجزيئية المتقدمة التي تسمح بالتحكم الزمني في التعبير الخاطئFMRP 20,21. هنا ، يتم تطوير المنهجية للحث على التلاعب الانتقائي للخلايا العصبية قبل المشبكية وما بعد المشبكية بشكل منفصل. تم تطوير هذه الطريقة في دائرة جذع الدماغ السمعي. يتم الكشف عن الإشارة الصوتية بواسطة خلايا الشعر في الأذن الداخلية السمعية ثم يتم نقلها إلى العقدة السمعية (AG ؛ وتسمى أيضا العقدة الحلزونية في الثدييات). تقوم الخلايا العصبية ثنائية القطب في AG بتعصيب خلايا الشعر بعملياتها المحيطية وترسل بدورها إسقاطا مركزيا (العصب السمعي) إلى جذع الدماغ حيث تنتهي في نواتين قوقعيتين أساسيتين ، النواة المغنطيسية (NM) والنواة الزاوية (NA). يمكن مقارنة الخلايا العصبية في NM هيكليا ووظيفيا بالخلايا الكثيفة الكروية لنواة القوقعة الأمامية البطنية للثدييات. داخل NM ، تتشابك الألياف العصبية السمعية (ANFs) على سوماتا الخلايا العصبية NM عبر المصباح النهائي الكبير للمحطات الطرفية22. أثناء التطور ، تنشأ الخلايا العصبية NM من المعينات 5 و 6 (r5 / 6) في الدماغ الخلفي23 ، بينما يتم اشتقاق الخلايا العصبية AG من الخلايا العصبية المقيمة في كيس الأذن24. هنا ، نصف الإجراء الخاص بضرب تعبير FMRP بشكل انتقائي في الخلايا العصبية AG قبل المشبكية وفي الخلايا العصبية NM بعد المشبكي بشكل منفصل.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحديد وظيفة الخلية المستقلة ل FMRP ، من الضروري معالجة تعبيرها في مجموعات الخلايا الفردية أو أنواع الخلايا. نظرا لأن إحدى الوظائف الرئيسية ل FMRP هي تنظيم التكوين المشبكي واللدونة ، فإن المعالجة الانتقائية لكل مكون متشابك لدائرة معينة هي شرط أساسي لفهم كامل لآلية FMRP في الا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ودعمت هذه الدراسة كل من: منحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32000697)؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم )؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم )؛ ومنحة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم برنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (202102080139) ؛ مؤسسة قوانغدونغ للعلوم الطبيعية (2019A1515110625 ، 2021A1515010619) ؛ صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (11620324)؛ منحة بحثية من المختبر الرئيسي للطب التجديدي ، وزارة التربية والتعليم ، جامعة جينان (رقم. ZSYXM202107); صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية في الصين (21621054) ؛ ومؤسسة البحوث العلمية الطبية في مقاطعة قوانغدونغ الصينية (20191118142729581). نشكر مركز التجارب الطبية بجامعة جينان. نشكر الدكتورة تيرا برادلي على التحرير الدقيق للمخطوطة.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
- Hagerman, R. J., et al. Fragile X syndrome. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).
- Hinds, H. L., et al. Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome. Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).
- Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens. Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).
- Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain. Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).
- Darnell, J. C., et al. FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism. Cell. 146 (2), 247-261 (2011).
- Bakker, C. E., Oostra, B. A. Understanding fragile X syndrome: insights from animal models. Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).
- Hanson, J. E., Madison, D. V. Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).
- Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).
- Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons. Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).
- Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network. Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).
- Higashimori, H., et al. Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).
- Hodges, J. L., et al. Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome. Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).
- Gonzalez, D., et al. Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus. Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).
- Bland, K. M., et al. FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner. Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).
- Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation. Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).
- Pfeiffer, B. E., et al. Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2. Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).
- Deng, P. Y., et al. FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels. Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).
- Yang, Y. M., et al. Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain. Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).
- Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. Developmental studies in fragile X syndrome. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).
- Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus. Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).
- Wang, X., et al. Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit. Development. 147 (21), (2020).
- Rubel, E. W., Fritzsch, B. Auditory system development: primary auditory neurons and their targets. Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).
- Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain. Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).
- Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development. Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
- Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem. Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).
- Evsen, L., Doetzlhofer, A. Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).
- Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis. Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).
- Wang, X. Y., et al. High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo. Scientific Reports. 5, 18321 (2015).
- Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation. Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).
- Li, H., et al. Islet-1 expression in the developing chicken inner ear. Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).
- Carr, C. E., Boudreau, R. E. Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl. Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).
- Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells. Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).
- Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system. Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).
- Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1. Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).
- Curnow, E., Wang, Y. New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology. Cells. 11 (10), 1628 (2022).
