Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo
Summary
Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.
Abstract
La proteína de retraso mental X frágil (FMRP) es una proteína de unión al ARNm que regula la traducción local de proteínas. La pérdida o disfunción de FMRP conduce a actividades neuronales y sinápticas aberrantes en el síndrome X frágil (FXS), que se caracteriza por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y problemas de comunicación social. Los estudios de la función de FMRP y la patogénesis del FXS se han realizado principalmente con Fmr1 (el gen que codifica FMRP) knockout en animales transgénicos. Aquí informamos un método in vivo para determinar la función autónoma celular de FMRP durante el período de ensamblaje del circuito y la formación sináptica utilizando embriones de pollo. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN de horquilla pequeña Fmr1 (shRNA) y un reportero de EGFP. Con este método, logramos una eliminación selectiva de FMRP en el ganglio auditivo (AG) y en uno de sus objetivos del tronco encefálico, el núcleo magnocellularis (NM), proporcionando así una manipulación específica del componente dentro del circuito AG-NM. Además, el patrón de mosaico de la transfección permite controles dentro de los animales y comparaciones de neuronas / fibras vecinas para mejorar la confiabilidad y la sensibilidad en el análisis de datos. El sistema vectorial inducible proporciona control temporal del inicio de la edición de genes para minimizar los efectos acumulativos en el desarrollo. La combinación de estas estrategias proporciona una herramienta innovadora para diseccionar la función autónoma celular de FMRP en el desarrollo sináptico y de circuitos.
Introduction
El síndrome X frágil (SXF) es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y comportamientos autistas. En la mayoría de los casos, el SXF es causado por una pérdida global de la proteína X frágil de retraso mental (FMRP; codificada por el gen Fmr1) que comienza en las primeras etapas embrionarias1. FMRP es una proteína de unión al ARN que normalmente se expresa en la mayoría de las neuronas y células gliales en el cerebro, así como en los órganos sensoriales 2,3,4. En los cerebros de mamíferos, la FMRP probablemente está asociada con cientos de ARNm que codifican proteínas que son importantes para diversas actividades neuronales5. Estudios de animales knockout convencionales Fmr1 demostraron que la expresión de FMRP es particularmente importante para el ensamblaje y la plasticidad de la neurotransmisión sináptica6. Varios modelos de knockout condicional y mosaico han demostrado además que las acciones y señales de FMRP varían según las regiones cerebrales, los tipos de células y los sitios sinápticos durante varios eventos de desarrollo, incluida la proyección axonal, el patrón dendrítico y la plasticidad sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La función aguda de FMRP en la regulación de la transmisión sináptica fue estudiada por la administración intracelular de anticuerpos inhibidores de FMRP o FMRP en cortes cerebrales o neuronas cultivadas15,16,17,18. Estos métodos, sin embargo, no ofrecen la capacidad de rastrear las consecuencias inducidas por la expresión errónea de FMRP durante el desarrollo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos in vivo para investigar las funciones autónomas celulares de FMRP está en gran necesidad, y se espera que ayude a determinar si las anomalías reportadas en pacientes con FXS son consecuencias directas de la pérdida de FMRP en las neuronas y circuitos asociados, o consecuencias secundarias derivadas de cambios en toda la red durante el desarrollo19.
El tronco cerebral auditivo de embriones de pollo ofrece un modelo excepcionalmente ventajoso para análisis funcionales en profundidad de la regulación FMRP en el desarrollo de circuitos y sinapsis. El fácil acceso a los cerebros embrionarios de pollo y la bien establecida técnica de electroporación in ovo para la manipulación genética han contribuido en gran medida a nuestra comprensión del desarrollo cerebral en las primeras etapas embrionarias. En un estudio recientemente publicado, esta técnica se combinó con herramientas moleculares avanzadas que permiten el control temporal de la expresión errónea de FMRP20,21. Aquí, la metodología es avanzada para inducir manipulaciones selectivas de neuronas presinápticas y postsinápticas por separado. Este método fue desarrollado en el circuito auditivo del tronco encefálico. La señal acústica es detectada por las células ciliadas en el oído interno auditivo y luego transportada al ganglio auditivo (AG; también llamado ganglio espiral en mamíferos). Las neuronas bipolares en el AG inervan las células ciliadas con sus procesos periféricos y, a su vez, envían una proyección central (el nervio auditivo) al tronco encefálico donde terminan en dos núcleos cocleares primarios, el núcleo magnocellularis (NM) y el núcleo angularis (NA). Las neuronas en el NM son estructural y funcionalmente comparables a las células esféricas tupidas del núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro del NM, las fibras nerviosas auditivas (ANF) hacen sinapsis en el somata de las neuronas NM a través del bulbo terminal grande de los terminales de Held22. Durante el desarrollo, las neuronas NM surgen de los rombómeros 5 y 6 (r5/6) en el cerebro posterior23, mientras que las neuronas AG se derivan de neuroblastos que residen en el otocisto24. Aquí, describimos el procedimiento para derribar selectivamente la expresión de FMRP en las neuronas AG presinápticas y en las neuronas NM postsinápticas por separado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para determinar la función autónoma celular de FMRP, es necesario manipular su expresión en grupos celulares individuales o tipos de células. Dado que una de las principales funciones de FMRP es regular la formación sináptica y la plasticidad, la manipulación selectiva de cada componente sináptico de un determinado circuito es un requisito previo para una comprensión completa del mecanismo FMRP en la comunicación sináptica. Usando electroporación in ovo de embriones d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio contó con el apoyo de: una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 32000697); el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (202102080139); la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (11620324); una beca de investigación del Laboratorio Clave de Medicina Regenerativa, Ministerio de Educación, Universidad de Jinan (No. ZSYXM202107); los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales de China (21621054); y la Fundación de Investigación Científica Médica de la provincia china de Guangdong (20191118142729581). Agradecemos al centro médico experimental de la Universidad de Jinan. Agradecemos a la Dra. Terra Bradley por la cuidadosa edición del manuscrito.
Materials
| Egg incubation | |||
| 16 °C refrigerator | MAGAT | Used for fertilized egg storage. | |
| Egg incubator | SHANGHAI BOXUN | GZX-9240MBE | |
| Fertilized eggs | Farm of South China Agricultural University | Eggs must be used in one week for optimal viability. | |
| Plasmid preparation | |||
| Centrifuge | Sigma | 10016 | |
| Fast green | Solarbio | G1661 | Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave. |
| Plasmid Maxi-prep kit | QIAGEN | 12162 | Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889 | Make 7.5M working solution in nuclase-free water. |
| Electroporation and Doxycycline Administration | |||
| Electroporator | BTX | ECM399 | |
| 1 mL / 5 mL Syringe | GUANGZHOU KANGFULAI | ||
| Dissecting microscope | CNOPTEC | SZM-42 | |
| Doxcycline | Sigma-Aldrich | D9891 | Use fresh aliquots for each dose and store at -20 °C. |
| Glass capillary | BEIBOBOMEI | RD0910 | 0.9-1.1 mm*100 mm |
| Laboratory parafilm | PARAFILM | PM996 | transparent film |
| Pipette puller | CHENGDU INSTRUMENT FACTORY | WD-2 | Pulling condition: 500 °C for 15 s |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Platinum elctrodes | Home made | 0.5 mm diameter, 1.5 mm interval. | |
| Rubber tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Tissue Dissection and Fixation | |||
| Forceps | RWD | F11020-11 | Tip size: 0.05*0.01 mm |
| Other surgery tools | RWD | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 °C for up to 1 week. |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | DOW | 01673921 | For black background plates, food-grade carbon powder is applied. |
| Sectioning | |||
| Cryostat | LEICA | CM1850 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | From bovine skin. |
| Sliding microtome | LEICA | SM2010 | |
| Immunostaining | |||
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse | Abcam | ab150113 | 1:500 dilution, RRID: AB_2576208 |
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit | Abcam | ab150078 | 1:500 dilution, RRID: AB_2722519 |
| DAPI | Abcam | ab285390 | 1: 1000 dilution |
| Fluoromount-G mounting medium | Southern Biotech | Sb-0100-01 | |
| FMRP antibody | Y. Wang, Florida State University | #8263 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2861242 |
| Islet-1 antibody | DSHB | 39.3F7 | 1:100 dilution, RRID: AB_1157901 |
| Netwell plate | Corning | 3478 | |
| Neurofilament antibody | Sigma-Aldrich | N4142 | 1:1000 dilution, RRID: AB_477272 |
| Parvalbumin antibody | Sigma-Aldrich | P3088 | 1:10000 dilution, RRID: AB_477329 |
| SNAP25 antibody | Abcam | ab66066 | 1:1000 dilution, RRID: AB_2192052 |
| Imaging | |||
| Adobe photoshop | ADOBE | image editing software | |
| Confocal microscope | LEICA | SP8 | |
| Fluorescent stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Olympus Image-Pro Plus 7.0 | OlYMPUS | commercial image processing software package |
References
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