通过纳流式细胞术表征单个细胞外囊泡跨膜蛋白

样品和试剂详细信息
选择来自不同细胞系的两种EV分离株用于展示荧光标记和随后的nFCM分析。两组EV均悬浮在PBS中并在-80°C下储存<3个月，但大多数其他条件在分离株之间有所不同。C2C12小鼠肌母细胞系代表骨骼肌细胞的胚胎前体，并在2D培养物中生长，在通过超速离心进行EV分离之前72小时内调节生长培养基。SW620是一种人结肠腺癌细胞系，在基本的生物反应器中生长，富集培养基超过7周，通过尺寸排阻色谱（SEC）进行EV分离，并从琼脂糖CL-2B柱中洗脱出的馏分7-9合并为单个样品。

虽然从CCM中分离和浓缩的EV是最容易处理的样品类型，但nFCM适用于大多数EV分离物，包括血清、血浆、尿液和脑脊液等生物流体。这些样品分析受益于对所有颗粒的nFCM SS检测，允许与NTA，TRPS和其他颗粒分析进行证实，同时以定量方式描述荧光标记的EV亚群以及总数的一部分，以实现多参数颗粒分析的无偏方法。也可以分析低处理样品，例如未澄清的尿液和富含EV的CCM，但需要低污染蛋白质。

这里使用的膜染料旨在整合到脂质双层中，具有用于膜负载的亲脂性部分和用于保留在质膜中的亲水染料²⁵。目前还没有完美的 EV 标记染料，选择时必须考虑几个标准，包括对 EV 的特异性、固定或透化的适用性以及 EV 标记的效率²⁶.

表面暴露表位的荧光偶联抗体标记已被证明是鉴定EV亚群的有效方法²⁷。方案优化的一个关键方面是满足而不是超过标记饱和点以结合所有可用的表位，而不会通过允许周围的缓冲液填充荧光未结合抗体²⁸来抑制低荧光颗粒的检测。此外，用于抗体标记的暴露结合位点的可用性可能受到多种因素的影响。EV的储存条件已被证明会影响EV的浓度和大小分布²⁹ ，观察结果也表明对抗体标记的影响³⁰。在某些情况下，表面电晕蛋白的存在、蛋白质修饰和分离技术的影响也可能对抗体标记产生影响。最终，随着荧光标记在电动汽车研究中的使用变得越来越普遍，多种分析技术的实验设计和优化将变得更加精细。

为了提高结果的准确性，可以包括几种对照，例如（1）PBS +染料对照，以评估某些染料中的胶束或聚集体形成，这些染料在nFCM分析中可能显示为SS +颗粒，（2）PBS +抗体对照，可能发生聚集体，尽管通常不足以散射足够的光进行SS检测，（3）EV样品+IgG抗体对照， 在流式细胞术中很常见，用于鉴定任何非特异性结合，（4）非EV颗粒样品+抗体/染料对照 – 当需要鉴定复杂颗粒样品中的EV时尤其重要，纯化的低密度脂蛋白（LDL）颗粒或EV耗尽/消融样品等对照可以作为阴性对照来验证选择性标记，（5）阳性对照很难设计，但验证细胞上的抗体是一种有用的包含物。

四环戊胺在EV上的介绍
该实验的抗体和膜标记证明了通过nFCM分析可以在短时间内获得高水平的定量数据。同时测量颗粒直径/浓度的关键物理属性与膜和/或蛋白质存在的表型测量，可以对颗粒分离中的亚群进行高水平的描述。

重要的是，在这两个EV样品中鉴定出三种与EV相关的“关键”四蛋白CD9，CD63，CD81的不同水平。CD9在C2C12衍生的EV和SW620中呈递量的比例最大，CD81和CD63分别是第二种也是最少的蛋白。

尽管在来自两种非常不同的细胞来源的EV的tetraspanin谱中观察到一些相似之处，但细胞系和患者来源的EV的CD9，CD63和CD81水平可能非常不同³¹。

两个EV样本之间CD63表达的差异与正在进行的“EV-ness”关键标识符的讨论特别相关。虽然CD63仅在~8%的SW620 EV中出现可能会出乎一些人的意料，但CD63被认为是按大小或密度分离的不同类型的EV的不良识别³²，并且已经鉴定出tetraspanin阴性EV，即使被描述为外泌体样³³。

在复杂颗粒分离中识别电动汽车
在细胞系和患者来源的EV中，EV tetraspanin谱的异质性警告不要依赖基于tetraspanin的EV捕获，并强调了未来对新的EV鉴定方法的需求³¹。如果可以证明EV特异性非常高，则独立于特定蛋白质的EV标记可以证明对从类似大小的非EV颗粒中识别EV非常有益。对于生物流体 EV 分离物尤其如此，因为有人建议人血浆中 EV 的浓度在 10 10 粒/mL 的范围内，而脂蛋白的测量值为每毫升^{10 16 14，34}。即使在 EV 富集时，比较四蛋白标志物和/或低密度脂蛋白标志物 ApoB 的颗粒阳性的研究表明，与 EV³⁵ 相比，游离血浆 （PFP） 样品中的 LDL 丰度高出 ~50-100 倍。

所使用的分离技术极大地影响了共分离的非EV颗粒的范围，例如极低密度脂蛋白（VLDL），中密度脂蛋白（IDL）和LDL³⁶。还有与 EV 结合的脂蛋白共分离物的描述，虽然可能发挥重要的生物学作用，但使实现 EV 纯样品成为一个具有挑战性的目标³⁵。

因此，可以说，应该更加关注对构成样品的颗粒的描述，而不是实现对纯粹但有限的电动汽车选择的分离。通过分别测量体积和颗粒计数的四西班牙蛋白丰度来实现颗粒的全面描述可能不足以准确确定 EV 浓度，特别是来自生物流体来源^36，37。如本实验所示，以基于层的方法鉴定亚群，显示总颗粒、EV 和呈现某些蛋白质的 EV，可以为纳米颗粒表征提供可靠的解决方案。对于涉及EV负载的项目，其设计用于未来的治疗应用²⁰ 以及识别CD63 + EV与线粒体³⁸等管腔货物。

电动汽车分析库中的nFCM
nFCM EV分析的优势在于数据可以证实和建立最常见的EV分析，并在物理数据集和表型数据集之间形成桥梁。然而，这是基于准确的标记方案，通常需要针对独特的标记试剂（如染料和抗体）进行优化。准确分析的一个关键标准是将标记的颗粒悬浮在非荧光缓冲液中，这依赖于去除过量的未结合荧光团或改进方案以不超过表位饱和度。

比较研究表明，电动汽车的nFCM尺寸提供的数据符合TRPS和冷冻透射电镜，这些技术被描述为比NTA更准确的电动汽车尺寸分析^10，39。然而，与任何基于光学的方法一样，在解释数据时，必须考虑EV异质光学特性的影响以及参考物质和EV光学特性之间的差异¹⁰。

蛋白质印迹一直是通过鉴定EV标志物来指示EV富集的关键方法⁴⁰。但是，证明颗粒上存在此类标记物的愿望推动了基于EV的流式细胞术分析的进步¹⁷。然而，提供可靠数据所需的分辨率目前最好通过有关散射光和荧光光的专用仪器来实现¹⁹。

nFCM提供了一种无偏的方法，通过使用侧向散射测量，最初描述与特定标志物无关的所有颗粒，允许与NTA，RPS和TEM¹的最常见技术进行证实，同时以定量方式添加类似于WB或Elisa的表型测量。