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Biology

Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

Published: July 26, 2022
doi:
10.3791/64020
, , , , , , ,
1NanoFCM Co., Ltd, 2School of Sport, Exercise and Health Sciences,Loughborough University, 3Biomolecular Sciences Research Centre,Sheffield Hallam University

Summary

Die neueste Generation von EV-Charakterisierungswerkzeugen ist in der Lage, eine einzelne EV-Analyse über mehrere Parameter gleichzeitig durchzuführen. Die Nano-Durchflusszytometrie misst alle biologischen Partikel größer als 45 nm ohne Markierung und identifiziert spezifische Eigenschaften von Subpopulationen durch eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungstechniken.

Abstract

Die Charakterisierung einzelner Partikel ist für die Erforschung extrazellulärer Vesikel zunehmend relevant geworden, von Massenanalysetechniken und Partikelanalysen der ersten Generation bis hin zu umfassenden Multiparametermessungen wie der Nano-Durchflusszytometrie (nFCM). nFCM ist eine Form der Durchflusszytometrie, die Instrumente verwendet, die speziell für die Nanopartikelanalyse entwickelt wurden, so dass Tausende von EVs pro Minute sowohl mit als auch ohne den Einsatz von Färbetechniken charakterisiert werden können. Die hochauflösende Seitenstreudetektion (SS) ermöglicht die Bestimmung von Größe und Konzentration für alle biologischen Partikel größer als 45 nm, während die gleichzeitige Fluoreszenzdetektion (FL) das Vorhandensein markierter Marker und Ziele von Interesse identifiziert. Markierte Subpopulationen können dann in quantitativen Partikeleinheiten/ml oder als Prozentsatz der durch Seitenstreuung identifizierten Partikel beschrieben werden.

Hier werden EVs, die von konditionierten Zellkulturmedien (CCM) abgeleitet sind, sowohl mit einem Lipidfarbstoff markiert, um Partikel mit einer Membran zu identifizieren, als auch mit Antikörpern, die spezifisch für CD9, CD63 und CD81 als gemeinsame EV-Marker sind. Messungen von Vergleichsmaterial, einem Konzentrationsstandard und einem Größenstandard von Siliziumdioxid-Nanokugeln sowie markiertem Probenmaterial werden in einer 1-minütigen Analyse analysiert. Die Software wird dann verwendet, um das Konzentrations- und Größenverteilungsprofil aller Partikel unabhängig von der Markierung zu messen, bevor die Partikel bestimmt werden, die für jedes der Markierungen positiv sind.

Die simultane SS- und FL-Detektion kann flexibel mit vielen verschiedenen EV-Quellen und Markierungszielen, sowohl extern als auch intern, eingesetzt werden, um EV-Proben umfassend und quantitativ zu beschreiben.

Introduction

Was sind Elektrofahrzeuge?
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind der Sammelbegriff für eine Reihe von zellabgeleiteten membranösen Partikeln, die in vielen normalen Zell- und Gewebeaktivitäten enthalten sind. Ihre Auswirkungen auf ein breites Spektrum wissenschaftlicher Bereiche und ihre potenzielle klinische Relevanz haben zu einem Wachstum der EV-Forschung und des industriellen Interesses geführt1. Die Small EV (sEV) -Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf Exosomen, 40-100 nm-Partikel, die sich in den frühen Endosomen vor der Reifung bilden und durch Fusion von multivesikulären Körpern (MVB) an die Plasmamembran freisetzen, sowie Mikrovesikel, die direkt aus der Plasmamembran knospen und 80-1.000 nm-Partikel bilden2. Eine dritte EV-Population sind apoptotische Körper, 50-1.500 nm-Partikel, die während des Zelltods gebildet werden, was bedeutet, dass ihr relatives Verhältnis zu anderen EVs stark variabel sein kann3.

Da EV-Eigenschaften Veränderungen darstellen können, die in ihrer Ursprungszelle/ihrem Ursprungsgewebe auftreten, besteht Potenzial für ihre Verwendung in der Diagnostik. Verschiedene “Omics”-Analysen haben begonnen, Marker für den Zellursprung und den Krankheitszustand zu identifizieren, die eine nicht-invasive Beurteilung von Patienten ermöglichen können, die EV-Quellen wie Blutplasma/Serum, Urin, Speichel und zerebrale Rückenmarksflüssigkeit (CSF) verwenden4,5. Eine treibende Kraft hinter diesen Innovationen im Zusammenhang mit Elektrofahrzeugen sind neue Charakterisierungstechniken, die bisherige Einschränkungen überwinden.

Die Notwendigkeit und Herausforderungen der Charakterisierung einzelner Elektrofahrzeuge
Die Charakterisierung einzelner EVs wird sowohl für die Validierung und Beschreibung von EV-Isolaten als auch für die Aufklärung der Schlüsselmerkmale dieser Nanopartikel für die Progression von EV-basierten Therapien und Diagnostika immer wichtiger6. Abhängig von der EV-Quelle und dem Verwendungszweck kann die Analyse der Reinheit, die oft als Verhältnis von EV- zu Nicht-EV-Partikeln oder als EV zu freiem Protein beschrieben wird, erhebliche Datenmengen aus mehreren Analysen erfordern7.

Partikelzählung und Größenmessungen in EV-Publikationen stützten sich bisher stark auf Nanopartikel-Tracking (NTA), resistive Pulsmessung (RPS) und Elektronenmikroskopie (EM)2. Standard-NTA und RPS sind nicht in der Lage, EVs von Nicht-EV-Partikeln zu unterscheiden, und haben ihre eigenen Vorbehalte wie langsamer Durchsatz8 und ungeeignete untere Nachweisgrenze, die mit NTA 9,10,11 beobachtet wird.

Die Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 waren in der Vergangenheit wichtige Identifikatoren für das Vorhandensein von EVs in EV-Isolierungen/-Zubereitungen. Häufig werden Western Blotting (WB) und Dot Blotting Techniken verwendet, um die Anreicherung dieser Proteine in EV-Isolaten im Vergleich zu Zelllysat12 zu zeigen. Der Mangel an Quantifizierung dieser Methoden und die Heterogenität dieser EV-Marker sowohl hinsichtlich der Darstellung innerhalb von EV-Subpopulationen als auch der zell-, gewebe- oder patientenbezogenen Variation fördern jedoch fortgeschrittene Analysetechniken, die die physikalische und phänotypische Charakterisierung vereinheitlichen13.

Nano-Durchflusszytometrie als umfassende EV-Analysetechnik
Die Bestimmung der tatsächlichen EV-Konzentrationen erfordert die Identifizierung intakter Partikel und einen universellen Marker, insbesondere in komplexen Partikelisolaten, mit einer Auflösung, die in der Lage ist, alle EVs zu detektieren und sie gleichzeitig von Nicht-EV-Partikeln zu unterscheiden14.

Die Nano-Durchflusszytometrie (nFCM) ist eine Technik, die eine unmarkierte Analyse von Partikeln mit einer Größe zwischen 45 und 1.000 nm ermöglicht und gleichzeitig fluoreszierende Markierung und Detektion zur Identifizierung von Partikelsubpopulationen verwendet. Ein wesentlicher Unterschied zur herkömmlichen Durchflusszytometrie ist die Verwendung von Geräten für die Nanopartikelanalyse, die die größte Auflösung ermöglichen15. Die EV-Analyse, die konventionelle Durchflussinstrumente verwendet, die für die Analyse kleiner Partikel umfunktioniert wurden, verbessert sich, hat aber immer noch Schwierigkeiten, die Auflösung zu erreichen, um <100 nm EVs16,17 zu erkennen und zu analysieren. Die Bead-basierte Durchflusszytometrie ist eine weitere Anpassung, die häufig für die EV-Analyse eingesetzt wird, aber dies beseitigt die Möglichkeit der Einzelpartikeldetektion und führt zu einfangsbasierten Verzerrungen18.

nFCM profitiert von einer unteren Nachweisgrenze von ~45 nm im Seitenstreukanal (SS) für die EV-Analyse und nutzt SS-Triggerung. Dies kann als “Particle First” -Analyse betrachtet werden, da es bedeutet, dass Ereignisse ein SS-Signal liefern müssen, das einen festgelegten Schwellenwert vor der Analyse der Fluoreszenzintensität überschreitet. Dadurch werden Fehlalarme wie abgebaute Membran- und Fluorophoraggregationen entfernt und die Analyse auf intakte EVs15 fokussiert. SS-Messungen werden auch verwendet, um einzelne Partikel im Vergleich zu einem viermodalen Siliziumdioxid-Nanosphärenstandard19 zu dimensionieren. Die Fluoreszenzmessungen werden an zwei weiteren Detektoren durchgeführt, die drei gleichzeitige Messungen für jedes Partikel ermöglichen, um Partikelkonzentration, Größe und Vorhandensein von Markern oder anderen interessanten Zielen zu beschreiben, um EV-Subpopulationenzu identifizieren 20.

Im folgenden Experiment werden SS- und Fluoreszenzmessungen (FL) verwendet, um >45-nm-Partikel zu messen, die Untergruppe der membranpositiven EVs zu zeigen und CD9-, CD63- und CD81-Präsentation auf EV-Subpopulationen zu identifizieren. Sowohl die Konzentration dieser Subpopulationen als auch ihr Anteil an den von SS gemessenen Gesamtpartikeln werden ebenso beschrieben wie ihre Größenprofile.

Protocol

1. Einrichtung des nFCM-Instruments und Messungen der nFCM-Standards HINWEIS: Vor Beginn der Datenerfassung für Proben werden drei Messungen durchgeführt, um die korrekte Ausrichtung des nFCM-Instruments zu validieren und einen starken Vergleich zwischen den Instrumenten zu ermöglichen. Dies sind der Konzentrationsstandard/Qualitätskontrolle (QC), der Größenstandard und ein Rohling. Die QC-Perlen 1:100 in destilliertem Wasser in einem geeigneten 0,6 μL Röhrchen verdünnen und in die Laderampe legen. Wählen Sie im Dropdown-Menü Probenfluss die Option Boosting aus, um die QC-Probe für 45 s in das System einzuführen und die vorherige Probe/Reinigungslösung vollständig zu ersetzen.Stellen Sie während der Verstärkung die Laserleistung auf die voreingestellte Vorlage für QC-Perlen “250 nm FL QC-Standard” ein, z. B. 10/40 mW für den blauen Laser, 20/50 mW für den roten Laser, mit 0,2% SS-Zerfall. Wählen Sie im selben Menü unten die Option Abtastdruck aus, um den Systemdruck zu reduzieren. Stellen Sie den automatischen Abtastdruck auf 1,0 kPa ein, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Initiieren Sie die 1-Minuten-Analyse, indem Sie in den Erfassungssteuerelementen die Option Aufnahmezeit auswählen. Die Daten werden auf dem Punktdiagramm dargestellt, das eine logarithmische Skala für die SS-Intensität und eine ausgewählte FL-Intensität zeigt. Geben Sie den Dateinamen und die Probenverdünnung ein, bevor Sie die Datei speichern. Wählen Sie Entladen, um das Rohr aus der Laderampe zu entfernen. Durch 150 μL Reinigungslösung ersetzen und >30 s reinigen, indem Sie Boosting auswählen, bevor Sie die Reinigungslösung entfernen, indem Sie Entladen auswählen.Entfernen Sie überschüssige Reinigungslösung aus der Kapillarspitze mit einem Röhrchen mit 150 μL Wasser. Die Standardperlen der Größe 1:100 in Wasser verdünnen und 100 μL in die Laderampe laden, bevor Sie die Probe für 45 s verstärken . Stellen Sie die Laserleistung auf die voreingestellte Vorlage “S16 exo 68-155 nm” ein. Diese Einstellung gilt sowohl für den Größenstandard als auch für Proben, die Elektrofahrzeuge < 200 nm enthalten. Zum Beispiel 15/40 mW für den blauen Laser, 20/50 mW für den roten Laser, mit 0,2% SS-Zerfall. Wählen Sie Probenahme und fahren Sie mit der Aufzeichnung der Probe für 1 Minute wie zuvor fort. Führen Sie die dritte Messung entweder mit einer Wasser- oder PBS-Probe durch, um eine Leermessung Ihres Eluenten zu erstellen und Fehlalarme für die Entfernung durch die Software zu identifizieren. Die Eingabe der Standardmaße wird im folgenden Abschnitt beschrieben. 2. Bestimmung der Partikelkonzentration einer unmarkierten Probe und Erstellung eines PDF-Berichts Die unmarkierte EV-Probe in PBS wird auf einen geeigneten Partikelkonzentrationsbereich für die nFCM-Analyse verdünnt, 1 x 10 8- 5 x 108 Partikel/ml. Laden Sie 10-100 μL der verdünnten Probe in die Ladebucht. Wenn die Partikelkonzentration unbekannt ist, beginnen Sie mit einer Verdünnung der EV-Probe im Verhältnis 1:100. Die Probenkonzentration kann schnell durch die Größe des Laserspots auf der CCD-Kamera während des Boostings oder durch Beobachtung des Event Burst Trace während der Probenahme angenähert werden. Erhöhen Sie die geladene Probe für 45 s, bevor Sie Sampling auswählen und 1 Minute lang aufzeichnen, speichern Sie wie zuvor beschrieben. Um mit der Analyse dieser Daten zu beginnen, wechseln Sie von der Registerkarte Erfassung zur Registerkarte Analyse . Öffnen Sie die gespeicherten nfa-Dateien. Um eine genaue Probenmessung zu ermöglichen, verwenden Sie die beiden Standardmessungen, die vor der Probenmessung durchgeführt wurden, um Werte für den Probenvergleich sowie den Blindwert festzulegen. Erstellen Sie die Größenstandardkurve für die Konvertierung von SS in Durchmesser, indem Sie zuerst die Standarddatei auswählen und das Werkzeug zum Festlegen von Schwellenwerten (auch als automatischer Schwellenwert bezeichnet) verwenden. Der Schwellenwert, der in der Ereignis-Burst-Spur sichtbar ist, identifiziert die minimale Signalintensität, die erforderlich ist, damit ein Ereignis als signifikant angesehen wird. Überprüfen Sie bei festgelegtem Schwellenwert, ob die x- und y-Parameter SS-H oder SS-A auf der x-Achse und FITC-A auf der y-Achse sind. Öffnen Sie das Standardwerkzeug zur Kurvengenerierung und wählen Sie S16 exo 68-155 nm als Größenvorlage aus. Klicken Sie auf Find Peaks , um die Peak-SS-Intensitäten als Partikel mit einem Durchmesser von 68, 91, 113 oder 155 nm zu identifizieren. Überprüfen Sie, ob die SS-Durchmesser-Kurve mit einem r-Wert nahe 1 erzeugt wurde, bevor Sie das Fenster schließen. Stellen Sie den Konzentrationsstandard ein, indem Sie die gespeicherte Datei auswählen und auf Count STD klicken. Geben Sie die Partikelkonzentration des Standards ein. Nachdem Sie die Standardinformationen festgelegt haben, wählen Sie die EV-Beispieldatei aus und legen Sie den Schwellenwert fest. Wählen Sie die leere Datei aus und klicken Sie auf Leer setzen , um die Anzahl der falsch positiven Ergebnisse zu ermitteln, die aus der Stichprobenzählung entfernt werden sollen. Dies sollte mit dem gleichen Schwellenwert wie Ihre Stichprobe erfolgen. Kehren Sie zur EV-Beispieldatei zurück. Öffnen Sie das PDF-Generierungswerkzeug und wählen Sie Größe und Konzentration. Geben Sie die Verdünnungen der Probe ein. Die Konzentration der Probe und die Größenverteilung der Partikel werden gezeigt. 3. Probenkennzeichnung HINWEIS: Für eine umfassende Analyse der Partikel in Suspension können zwei Färbestrategien gleichzeitig verwendet werden. Markierungsprotokolle erfordern oft eine Optimierung für neue Antikörper oder Probenquellen. Verdünnen Sie einen Teil der EV-Probe auf eine Konzentration von 1,25 x 1010 Partikel/ml in PBS. 8 μL der verdünnten EV-Probe werden mit 1 μL Antikörper und 1 μL Farbstoff für eine Partikelkonzentration von 1 x 10 10 Partikeln/ml inkubiert (die Gesamtpartikel werden 1 x 108 suspendiert in10 μL sein). Das Inkubationsverhältnis für den Antikörper beträgt in diesem Fall 1:50 (1 μL 1:5 Antikörper).Verwenden Sie während der Optimierung mehr als drei verschiedene Konzentrationen von Antikörpern oder Farbstoffen, um Daten bereitzustellen, die darauf hinweisen, dass das Protokoll eine maximale Epitopbindung ohne Übersättigung der gewählten Markierung ermöglicht, was die Identifizierung von Fluoreszenzereignissen niedriger Intensität beeinträchtigen kann. Die Inkubationskonzentration für den Membranfarbstoff beträgt 40 nM (1 μL von 400 nM). Mischen Sie die 10 μL-Probe durch Wirbeln für 5 s und inkubieren Sie bei RT für 30 min im Dunkeln.HINWEIS: Empfehlungen für Kontrollen sind in der Diskussion enthalten. Nach der Inkubation 1 μL der markierten Probe entnehmen und 1:50 in PBS in einem 0,6-ml-Röhrchen verdünnen. Laden Sie die Probe in die Laderampe und üben Sie einen Verstärkungsdruck für 45 s aus. Stellen Sie sicher, dass die Lasereinstellungen korrekt sind und die entsprechenden Linsen eingelegt sind. Wechseln Sie zum Abtastdruck und wählen Sie Aufnahmezeit. Nach der 1-minütigen Erfassung benennen Sie die Datendatei und speichern Sie. Entladen Sie die Probe und ersetzen Sie sie durch Reinigungslösung. Erhöhen Sie diese für >30 s, bevor Sie die nächste beschriftete Probe laden. 4. nFCM-Analyse-PDF-Generierung für Subpopulationsanalyse Wenden Sie bei der PDF-Generierung die gleichen Standards wie zuvor an. Nur die Leermessung wird anders eingestellt. Wählen Sie die Beispieldatei aus, und legen Sie den Schwellenwert fest. Ändern Sie im Punktdiagramm die y-Achse, um FL-Messungen aus dem grünen oder roten Kanal anzuzeigen. Wählen Sie das quadratische Gating-Werkzeug aus und verwenden Sie einen Linksklick, um ein Quadrat um die FL+-Population zu zeichnen. Öffnen Sie die leere Messdatei und klicken Sie auf Set Blank , bevor Sie zur Beispieldatei zurückkehren. Öffnen Sie das PDF-Generierungstool wie zuvor, und die Größenverteilung, Konzentration und der Prozentsatz (im Vergleich zu allen SS+-Ereignissen) werden für die FL+-Teilpopulation identifiziert.Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Teilpopulation von Interesse, die als “Insgesamt, P1, P2 usw.” identifiziert wurde.

Representative Results

Tetraspanin-Präsentation zu SW620-abgeleiteten EVs und C2C12-abgeleiteten EVsDie moderne Analyse der Häufigkeit der wichtigsten Tetraspanine CD9, CD63 und CD81 auf EVs aus einer Vielzahl von Quellen hat die extreme Variabilität ihrer Anwesenheit sowohl in Massenanalysen als auch bei der Analyse ihrer Präsentation auf EV-Subpopulationen hervorgehoben21. Dies hängt wahrscheinlich mit der Verfügbarkeit verschiedener Biogenesewege wie den ESCRT-abhängigen und unabhängigen Signalwegen22 zusammen. CD9 wurde auf dem größten Prozentsatz von C2C12 EVs bei ~ 50% präsentiert, wobei CD63 Präsentation nur ~ 30% in Abbildung 1 präsentiert. Wenn die Markierung mit allen drei Anti-Tetraspaninen in einer Inkubation durchgeführt wurde, wurde gezeigt, dass ~70% der Partikel mindestens einen der EV-Marker aufweisen. Wiederholte Messungen zeigten die niedrigste Standardabweichung für die CD9/63/81-Markierung von C2C12-EVs bei ~ 3,8%, während dies ~ 8,1% für die CD81-markierten C2C12-EVs betrug. SW620-abgeleitete EVs zeigten ein anderes Tetraspanin-Profil, mit einem viel größeren Unterschied zwischen dem am häufigsten präsentierten CD9 bei ~ 40% und dem am wenigsten präsentierten CD63 bei ~ 7%. Ähnlich wie bei den C2C12-EVs war CD9 auf der Mehrheit der Tetraspanin-positiven Population vorhanden, da die kombinierte CD9/63/81-Markierung ~42% der Partikel identifizierte, die mindestens einen der drei Marker aufwiesen. Die Mehrheit der von C2C12 abgeleiteten Partikel, die gesamte SS+-Population, hatte eine Größe von 45-120 nm mit einem mittleren Durchmesser von ~ 65 nm. Die Größenprofile für jede der einzelnen Tetraspanin-markierten EV-Subpopulationen, die in Abbildung 1 gezeigt werden, sind einander ähnlich und zeigen eine größere Mediangröße von ~75-85 nm und weniger <65 nm EVs im Vergleich zur gesamten Partikelpopulation. SW620-abgeleitete Partikel lagen zwischen 45-160 nm mit einer mittleren Größe von ~65 nm, was eine schiefe Verteilung zeigt. Die Tetraspanin-markierten EVs zeigen eine normalere Verteilung und einen größeren Mediandurchmesser zwischen 90-110 nm, mit ähnlichen Verteilungen zwischen einzelnen Tetraspanin-positiven Subpopulationen. Während die am meisten und am wenigsten präsentierten Tetraspanine für diese beiden Zelllinien gleich sind, unterscheidet sich ihre proportionale Repräsentation stark und es gibt einen interessanten Unterschied zwischen der potenziellen Co-Präsentation von Tetraspaninen, die aus dem Unterschied in der CD9-Positivität und der CD9/63/81-Positivität beobachtbar ist. Kombination von EV-Membranmarkierung mit AntikörpermarkierungDie Doppelschichtmembran von EVs bietet ein allgemeineres Markierungsziel, das eine Unterscheidung von ähnlich großen Nicht-EV-Partikeln wie Proteinaggregaten und einigen Formen von LDL mit Lipidmonoschichten23 ermöglichen kann. Die Spezifität dieser Art der Markierung muss validiert werden, da gezeigt wurde, dass einige gängige Membranfarbstoffe, die in der EV-Forschung verwendet werden, auch an Nicht-EV-Partikel binden24. Die Membranmarkierung zeigte wiederholt ~ 80% Positivität von C2C12-abgeleiteten EVs und SW620-EVs. Die SS-Intensität (SS-H) zeigt eine gute Korrelation mit der FITC-Intensität in den Punktdiagrammen der in Abbildung 2 gezeigten C2C12- und SW620-Ergebnisse. Dies ist zu erwarten, da die SS-Intensität relativ zur Partikelgröße und damit zur Membranoberfläche ist. Die Mehrheit der mit Antikörpern markierten EVs war auch positiv für die Membranmarkierung und zeigte doppelt positive Prozentsätze (FITC+ & APC+), die den Tetraspanin-positiven Prozentsätzen sehr ähnlich waren. FITC vs APC Punktdiagramme zeigen eine leichte Korrelation zwischen Membran- und Tetraspanin-Markierung, wobei die CD63-Markierung die schwächste Korrelation zur Membranmarkierung zu zeigen scheint. Es wurden nur wenige Ereignisse nachgewiesen, die positiv für die Antikörpermarkierung, aber negativ für die Membranmarkierung waren. Reproduzierbarkeit, doppelte Etikettiereffizienz und alternative DatenausgabenEine wichtige Überlegung bei der Entwicklung von nFCM-Experimenten ist die Interaktivität von Fluorophoren oder Markierungen. Abbildung 3a zeigt, dass die Wiederholung der Antikörpermarkierung mit und ohne zusätzliche Membranmarkierung zu sehr ähnlichen %-Positivitätsmessungen führt. Insbesondere die SW620-Beschriftung zeigt sehr geringe Unterschiede zwischen den beiden Messsätzen. Dies zeigt eine begrenzte Interferenz zwischen der Farbstoff- und Antikörperbindung und unterstreicht auch eine gute Reproduzierbarkeit bei der Wiederholung der EV-Markierung. Intensitätsmessungen, sowohl Seitenstreuung als auch Fluoreszenz, können exportiert werden, um für jedes einzelne gemessene Partikel zu glänzen. Daraus können wir mittlere Fluoreszenzintensitätsmessungen (MFI) generieren, um vergleichende Näherungen an die Häufigkeit unseres markierten Ziels zu liefern. MFI für die fluoreszierenden Populationen von C2C12-abgeleiteten EVs deuten auf eine etwas niedrigere Präsentation von CD63 und CD81 mit MFI-Messungen von ~550 bzw. ~600 hin, verglichen mit den ~850 MFI für CD9+ EVs. Die Maßeinheiten für MFI sind in diesem Fall FL-A und sind nicht gegen eine Fluoreszenzkalibrierung genormt. Die Verwendung aller drei Antikörper löst keine viel größere Fluoreszenz aus als nur die CD9-Markierung. Dies unterscheidet sich stark von den SW620 MFI-Messungen, die darauf hindeuten, dass die Verwendung eines Cocktails aus allen drei Antikörpern ein größeres Fluoreszenzsignal für markierte EVs liefert als die Verwendung einer einzelnen Antikörpermarkierung. Die von der NanoFCM-Software erzeugten Größenverteilungshistogramme können auch in Excel exportiert werden, so dass dreifache Datensätze überlagert werden können. Die Größenverteilungsprofile in Abbildung 3 ähneln denen in Abbildung 1 , enthalten jedoch Fehlerindikatoren. Die mediane EV-Größe der Tetraspanin-positiven Subpopulationen in C2C12-abgeleiteten EVs zeigt einen Median von etwa 70 nm, etwas größer als der 60-nm-Durchschnitt der gesamten Partikelpopulationen. SW620 EVs, die positiv für Tetraspanin-Marker sind, sind größer und zeigen Spitzen bei ~ 100 nm. Abbildung 1: CD9-, CD63- und CD81-positive EV-Subpopulationen, identifiziert durch Antikörpermarkierung . (A) Balkendiagramm, das den Prozentsatz der markierten EVs im Vergleich zu den von SS beobachteten Gesamtpartikeln für C2C12-abgeleitete EVs zeigt. (B) Balkendiagramm, das den Prozentsatz der markierten EVs im Vergleich zu den von SS beobachteten Gesamtpartikeln für SW620-abgeleitete EVs zeigt. (C) Repräsentative Größenverteilungsprofile für von C2C12 abgeleitete Elektrofahrzeuge. Jedes Histogramm stammt aus den PDFs, die für die erste Messung von dreifachen Datensätzen generiert wurden. (D) Repräsentative Größenverteilungsprofile für von SW620 abgeleitete Elektrofahrzeuge. Jedes Histogramm stammt aus den PDFs, die für die erste Messung von dreifachen Datensätzen generiert wurden. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von dreifachen Messungen derselben markierten Proben dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Membranmarkierung und Antikörpermarkierung von CD9, CD63, CD81 mit EV-Subpopulationen. (A) Balkendiagramm mit Membran+%, Tetraspanin+ % und double+ % für C2C12 EVs. (B) Balkendiagramm mit Membran+%, Tetraspanin+ % und double+ % für SW620 EVs. (C) Repräsentative SS vs. FITC Punktdiagramme, die Gating für die Membran-positive Population zeigen. (D) Repräsentative FITC vs. APC Dot Plots, die Gating für doppelt positive Population von EVs aus C2C12 zeigen. (E) Repräsentative FITC vs. APC-Punktdiagramme, die Gating für doppelt positive Population von EVs von SW620 zeigen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von dreifachen Messungen derselben markierten Proben dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Bewertung der Variation bei wiederholten Messungen . (A) Balkendiagramme, die die prozentuale Positivität der Antikörpermarkierung mit und ohne zusätzliche Membranmarkierung zeigen. (B) Mittlere Fluoreszenzintensitätsmessungen für gated EV-Teilmengen. (C) Gemittelte Größenverteilungshistogramme für dreifache Datensätze für C2C12 EVs. (D) Gemittelte Größenverteilungshistogramme für dreifache Datensätze für SW620 EVs. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von dreifachen Messungen derselben markierten Proben dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Proben- und Reagenziendetails
Zwei EV-Isolate aus separaten Zelllinien wurden für die Demonstration der Fluoreszenzmarkierung und die anschließende nFCM-Analyse ausgewählt. Beide EV-Sets wurden in PBS suspendiert und bei -80 °C für <3 Monate gelagert, aber die meisten anderen Bedingungen waren zwischen den Isolaten unterschiedlich. Die C2C12-Maus-Myoblasten-Zelllinie stellt einen embryonalen Vorläufer von Skelettmuskelzellen dar und wurde in 2D-Kultur gezüchtet, wobei das Wachstumsmedium über 72 h vor der EV-Isolierung durch Ultrazentrifugation konditioniert wurde. SW620 ist eine humane Kolon-Adenokarzinom-Zelllinie und wurde in einem rudimentären Bioreaktor gezüchtet, der Medien über 7 Wochen anreicherte, wobei die EV-Isolierung durch Größenausschlusschromatographie (SEC) durchgeführt wurde und die Fraktionen 7-9 aus Sepharose-CL-2B-Säulen in einer einzigen Probe kombiniert wurden.

Während aus CCM isolierte und konzentrierte EVs die am einfachsten zu verarbeitenden Probentypen sind, ist nFCM auf die meisten EV-Isolate anwendbar, einschließlich Biofluide wie Serum, Plasma, Urin und Liquor. Diese Probenanalysen profitieren von der nFCM-SS-Detektion aller Partikel, die eine Bestätigung mit NTA-, TRPS- und anderen Partikelanalysen ermöglicht und gleichzeitig die fluoreszenzmarkierten EV-Subpopulationen in quantitativer Hinsicht sowie einen Teil der Gesamtmenge für einen unvoreingenommenen Ansatz der Multiparameter-Partikelanalyse beschreibt. Die Analyse von niedrig verarbeiteten Proben ist ebenfalls möglich, wie z. B. ungeklärtem Urin und mit EV angereichertem CCM mit dem Vorbehalt, dass ein wenig kontaminiertes Protein erforderlich ist.

Der hier verwendete Membranfarbstoff soll sich in die Lipiddoppelschicht integrieren, wobei ein lipophiler Teil für die Membranbeladung und ein hydrophiler Farbstoff für den Verbleib in der Plasmamembran25 vorgesehen sind. Derzeit gibt es keinen perfekten EV-Kennzeichnungsfarbstoff, und bei der Auswahl müssen mehrere Kriterien berücksichtigt werden, darunter die Spezifität für Elektrofahrzeuge, die Eignung mit Fixierung oder Permeabilisierung und die Effizienz der EV-Kennzeichnung26.

Die Markierung fluoreszierender konjugierter Antikörper von oberflächenexponierten Epitopen hat sich als wirksame Methode zur Identifizierung von EV-Subpopulationen erwiesen27. Ein Schlüsselaspekt der Protokolloptimierung besteht darin, den Markierungssättigungspunkt zu erreichen und nicht zu überschreiten, um an alle verfügbaren Epitope zu binden, ohne die Detektion von Partikeln mit niedriger Fluoreszenz zu hemmen, indem der umgebende Puffer mit fluoreszierenden ungebundenen Antikörpern28 gefüllt werden kann. Darüber hinaus wird die Verfügbarkeit exponierter Bindungsstellen für die Antikörpermarkierung möglicherweise von mehreren Faktoren beeinflusst. Es wurde gezeigt, dass die Lagerbedingungen von EVs Konzentrations- und Größenprofile von EVsbeeinflussen 29 , wobei Beobachtungen auch auf Auswirkungen auf die Antikörpermarkierunghinweisen 30. Das Vorhandensein von oberflächlichen Coronaproteinen, Proteinmodifikationen und Auswirkungen von Isolierungstechniken können in einigen Fällen auch Auswirkungen auf die Antikörpermarkierung haben. Da die Verwendung von fluoreszierender Markierung für EV-Studien immer häufiger wird, werden das experimentelle Design und die Optimierung für mehrere Analysetechniken verfeinert.

Um die Genauigkeit der Ergebnisse zu erhöhen, können mehrere Kontrollen einbezogen werden, wie (1) PBS + Farbstoffkontrolle, um die Mizellen- oder Aggregatbildung in einigen Farbstoffen zu beurteilen, die in der nFCM-Analyse als SS+-Partikel auftreten können, (2) PBS + Antikörperkontrolle, Aggregate können auftreten, obwohl oft nicht groß genug, um genug Licht für die SS-Detektion zu streuen, (3) EV-Probe + IgG-Antikörperkontrolle, in der Durchflusszytometrie üblich und zur Identifizierung unspezifischer Bindungen verwendet, (4) Nicht-EV-Partikelprobe + Antikörper- / Farbstoffkontrolle – besonders wichtig, wenn EVs in komplexen Partikelproben identifiziert werden müssen, können Kontrollen wie gereinigte LDL-Partikel (Low-Density-Lipoprotein) oder EV-depletierte / abgetragene Proben als Negativkontrolle zur Validierung der selektiven Markierung dienen, (5) Positivkontrollen sind schwer zu entwerfen, aber die Validierung eines Antikörpers auf Zellen ist ein nützlicher Einschluss.

Präsentation von Tetraspaninen auf Elektrofahrzeugen
Die Antikörper- und Membranmarkierung dieses Experiments zeigt das hohe Niveau an quantitativen Daten, die in einem kleinen Zeitrahmen durch nFCM-Analyse gewonnen werden können. Die gleichzeitige Messung der wichtigsten physikalischen Eigenschaften des Partikeldurchmessers/der Partikelkonzentration mit den phänotypischen Messungen der Membran- und/oder Proteinpräsenz führt zu Beschreibungen von Subpopulationen auf hohem Niveau innerhalb der Partikelisolierung.

Wichtig ist, dass in diesen beiden EV-Proben unterschiedliche Konzentrationen der drei “wichtigen” EV-verwandten Tetraspanine, CD9, CD63, CD81 identifiziert wurden. CD9 wurde auf dem größten Anteil an EVs sowohl für C2C12-abgeleitete EVs als auch für SW620 präsentiert, wobei CD81 und CD63 die zweit- bzw. am wenigsten präsentierten Proteine waren.

Trotz einiger Ähnlichkeiten, die hier in den Tetraspaninprofilen von EVs aus zwei sehr unterschiedlichen Zellquellen beobachtet wurden, können die Spiegel von CD9, CD63 und CD81 zwischen Zelllinien- und Patienten-abgeleiteten EVs sehr unterschiedlich sein31.

Der Unterschied in der CD63-Expression zwischen den beiden EV-Proben ist besonders relevant für die laufende Diskussion über Schlüsselidentifikatoren der “EV-Ness”. Während die Präsentation von CD63 in nur ~ 8% der SW620-EVs von einigen unerwartet sein kann, wurde CD63 als schlechter Identifikator der verschiedenen Arten von EVs vorgeschlagen, die nach Größe oder Dichte isoliert sind32, und Tetraspanin-negative EVs wurden identifiziert, selbst wenn sie als exosomenartig33 beschrieben werden.

Identifizierung von EVs innerhalb komplexer Partikelisolierungen
Die Heterogenität von EV-Tetraspaninprofilen sowohl in Zelllinien- als auch in patientenabgeleiteten EVs warnt davor, sich auf die Tetraspanin-basierte Erfassung von EVs zu verlassen, und unterstreicht den zukünftigen Bedarf an neuen EV-Identifizierungsmethoden31. Die EV-Markierung unabhängig von spezifischen Proteinen könnte sich als sehr vorteilhaft für die Identifizierung von EVs aus ähnlich großen Nicht-EV-Partikeln erweisen, wenn die EV-Spezifität nachweislich sehr hoch ist. Dies gilt insbesondere für biofluide EV-Isolate, da vorgeschlagen wurde, dass die Konzentration von EVs im menschlichen Blutplasma im Bereich von 10 10 Partikeln / ml liegt, während Lipoproteine bei 1016 pro ml14,34 gemessen werden. Selbst bei EV-Anreicherung deuten Studien, die die Partikelpositivität für Tetraspaninmarker und / oder LDL-Marker ApoB vergleichen, auf ~ 50-100x größere Häufigkeit von LDL in plättchenfreien Plasmaproben (PFP) im Vergleich zu EV35 hin.

Die verwendete Isolierungstechnik beeinflusst stark den Bereich der co-isolierten Nicht-EV-Partikel wie Very Low-Density-Lipoproteine (VLDL), Intermediate-Density-Lipoproteine (IDL) und LDL36. Es gibt auch Beschreibungen von Lipoprotein-Coisolaten, die an EVs gebunden sind, was zwar möglicherweise eine wichtige biologische Rolle spielt, aber das Erreichen von EV-reinen Proben zu einem anspruchsvollen Ziel macht35.

Daher könnte argumentiert werden, dass ein größerer Fokus auf die Beschreibung von Partikeln gelegt wird, aus denen eine Probe besteht, anstatt eine reine, aber begrenzte Auswahl von EVs zu isolieren. Eine umfassende Beschreibung von Partikeln durch Messung der Tetraspaninhäufigkeit in Bulk- und Partikelzahlen kann nicht ausreichen, um EV-Konzentrationen genau zu bestimmen, insbesondere aus biofluiden Quellen36,37. Die Identifizierung von Subpopulationen in einem tierbasierten Ansatz, der Gesamtpartikel, EVs und EVs mit bestimmten Proteinen zeigt, wie in diesem Experiment gezeigt, kann eine robuste Lösung für die Charakterisierung von Nanopartikeln bieten. Dies war der Fall bei Projekten zur EV-Beladung mit Entwürfen für zukünftige therapeutische Anwendungen20 und zur Identifizierung von CD63+-Elektrofahrzeugen mit luminaler Fracht wie Mitochondrien38.

nFCM im Repertoire der EV-Analytik
Eine Stärke der nFCM-EV-Analyse ist die Art und Weise, wie Daten die gängigsten EV-Analysen bestätigen und darauf aufbauen und Brücken zwischen physikalischen und phänotypischen Datensätzen bilden können. Dies basiert jedoch auf genauen Kennzeichnungsprotokollen, die oft für einzigartige Markierungsreagenzien wie Farbstoffe und Antikörper optimiert werden müssen. Ein Schlüsselkriterium für eine genaue Analyse ist die Suspendierung markierter Partikel in einem nicht-fluoreszierenden Puffer, der entweder auf der Entfernung von überschüssigem ungebundenem Fluorophor oder der Verfeinerung der Protokolle beruht, um die Epitopsättigung nicht zu überschreiten.

Vergleichsstudien haben gezeigt, dass die nFCM-Dimensionierung von Elektrofahrzeugen Daten liefert, die mit TRPS und Kryo-TEM übereinstimmen, Techniken, die als genauer als NTA für die EV-Größenanalyse10,39 beschrieben werden. Wie bei jeder optischen Methode müssen jedoch der Einfluss heterogener optischer Eigenschaften für EVs und Unterschiede zwischen den optischen Eigenschaften von Referenzmaterial und EVs bei der Interpretation von Datenberücksichtigt werden 10.

Western Blotting war eine Schlüsselmethode zur Anzeige der EV-Anreicherung durch Identifizierung von EV-Markern40. Aber der Wunsch, das Vorhandensein solcher Marker auf Partikeln nachzuweisen, hat Fortschritte bei EV-basierten durchflusszytometrischen Analysen vorangetrieben17. Die notwendigen Auflösungen zur Bereitstellung robuster Daten werden jedoch derzeit am besten durch spezielle Instrumente in Bezug auf Streu- und Fluoreszenzlicht erreicht19.

nFCM bietet einen unvoreingenommenen Ansatz, bei dem zunächst alle Partikel beschrieben werden, die für spezifische Marker irrelevant sind, indem eine Seitenstreumessung verwendet wird, was eine Bestätigung mit den gebräuchlichsten Techniken von NTA, RPS und TEM1 ermöglicht und gleichzeitig eine phänotypische Messung ähnlich wie WB oder Elisa quantitativ hinzufügt.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken den Gruppen von Owen Davies und Nick Peake für die kontinuierliche Bereitstellung von Material und Fachwissen.

Materials

APC Anti-CD81 antibody (M38) abcam ab233259 Anti-Human CD81 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) Abcam ab82392 Anti-mouse CD9 APC
conjugated antibody
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted abcam ab82389 Anti-Human CD9 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse CD63 antibody biolegend 143905 Anti-Mouse CD63 APC
conjugated antibody
APC anti-mouse/rat CD81 antibody biolegend 104909 Anti-Mouse CD81 APC
conjugated antibody
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC invitrogen Via Fisherscientific A15712 Anti-Human CD63 APC
conjugated antibody
Celline AD1000 bioreactor Merck Z688037-5EA
Cleaning solution NanoFCM 17159 In house cleaning solution for nanoanalyser
EVs from C2C12 Gifted Mouse line
EVs from SW620 Gifted Human line
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe Cytoskeleton MG01 non toxic cell membrane dye
NanoAnalyzer NanoFCM nano-flow cytometer for measurement of single particles
PBS, pH 7.2 Gibco Via Fisherscientific 12549079 Salt solution for dilution of samples and antibodies
Snaplock Microtubes, 0.60mL Axygen Via Fisherscientific 11371944 Tubes required to load sample into nanoanalyser
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Lees, R., Tempest, R., Law, A., Aubert, D., Davies, O. G., Williams, S., Peake, N., Peacock, B. Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (185), e64020, doi:10.3791/64020 (2022).
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